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超微量紫外可見分光光度計(jì)常用于哪些方面？
閱讀：2000 發(fā)布時(shí)間：2021-6-18
超微量紫外可見分光光度計(jì)是通過檢測(cè)物質(zhì)波長(zhǎng)處或某一波長(zhǎng)范疇內(nèi)光的吸收度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量與定量分析的儀器設(shè)備，目前已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)、藥物學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的常用儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。
2、核酸的純度檢測(cè)
3、蛋白質(zhì)直接定量
4、比色法蛋白質(zhì)定量（顏色反應(yīng)）
5、OD600（菌落密度）
1、核酸的定量
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。
分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化都是正常的，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。影響吸光值A(chǔ)的幾個(gè)因素如下：
（1）核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等:在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液。
（2）樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了盡可能減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高(超過光度計(jì)的測(cè)試范
（3）操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
2、核酸的純度檢測(cè)
除了核酸濃度，超微量分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如：
（1）A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。
（2）A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。
（3）A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
3、蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。超微量分光光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的"背景"信息，設(shè)定此功能"開"。與測(cè)試核酸類似，要求A280的吸光值大于0.1A，的線性范圍在1.0-1.5之間。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
4、比色法蛋白質(zhì)定量（顏色反應(yīng)）
蛋白質(zhì)比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。
由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無可比性。所以在選擇比色法之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。
比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。因?yàn)楸壬笾械念伾怯幸欢ǖ陌胨テ?，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品)，都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色皿，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
5、OD600（菌落密度）
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。通過檢測(cè)600nm處細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)的吸光度，從而監(jiān)測(cè)微生物或其他細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)率。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。