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1.  預(yù)變性（Initial denaturation）

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略

延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.  最后延伸

在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。