化工儀器網(wǎng)
技術文章
PCR對照試驗結(jié)果好卻沒回收到目的片段參考見解
閱讀：354 發(fā)布時間：2022-7-25PCR對照試驗一般都會加陰性對照，陽性對照。如果你只想檢控PCR操作及擴增，就加水作為陰性對照，陽性質(zhì)?；蛘逥NA作為陽性對照。
如果你想監(jiān)控整個核酸提取過程，及PCR過程的話，那就從核酸提取開始，就將水作為陰性樣本做對照，含模板DNA的菌或者病毒或者組織作為陽性對照。然而，PCR對照試驗結(jié)果好卻沒回收到目的片段參考見解：
1、 連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。
2、 插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
3、插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
4、 帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
5、高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞