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大腸桿菌概述及菌株的分型
閱讀：974 發(fā)布時(shí)間：2023-7-17大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡(jiǎn)單,培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì),倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應(yīng)用zui 廣泛,最成功的表達(dá)體系,常做高效表達(dá)的shou 選體系。真核基因在大腸桿菌中表達(dá),必須有合適的表達(dá)載體(Vector),常用載體:pBV220,pET系統(tǒng)。
一、目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的情況:
大腸桿菌更適合原核基因的表達(dá),外源基因表達(dá)產(chǎn)量與單位體積產(chǎn)量是正相相關(guān)的,而單位體積產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和每個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相相關(guān).細(xì)胞濃度與生長(zhǎng)速率,外源基因拷貝數(shù)和表達(dá) 產(chǎn)物產(chǎn)量之間存在動(dòng)態(tài)平衡,單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)量又與外源基因拷貝數(shù),基因表達(dá)效率,表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性和細(xì)胞代謝負(fù)荷等因素有關(guān)。
二、大腸桿菌的菌落形態(tài)：
大腸桿菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上面都是一樣的,圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起；典型的大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征為：深紫黑色、光滑、濕潤(rùn)、帶有金屬光澤的圓形菌落。
大腸桿菌是動(dòng)物腸道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定條件下引起疾病 。大腸桿菌的血清型能夠引起人體或動(dòng)物胃腸道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃腸道感染以外，還會(huì)引起尿道感染、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎以及敗血型感染等。
三、大腸桿菌菌株的分型：
1：DH5a菌株
DH5a是一種常用于質(zhì)?？寺〉木辍.coliDH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1
2：BL21(DE3)菌株
該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）
3：BL21(DE3)pLysS菌株
該菌株含有質(zhì)粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾目的蛋白的表達(dá)。該菌適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr
4：JM109菌株
該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’
5：TOP 10菌株
該菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。
基因型：F-，mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG
6：HB101菌株
該菌株遺傳性能穩(wěn)定，使用方便，適用于各種基因重組實(shí)驗(yàn)
基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1M110或SCS110
大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一個(gè)胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都會(huì)產(chǎn)生dam,dcm，從而受到甲基化的影響.部分限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的內(nèi)切酶說明中均有說明。大多數(shù)酶切位點(diǎn)的甲基化不影響切割，而有些會(huì)影響，如XbaI,BclI等。而且甲基化只發(fā)生在特定序列，以XbaI為例，只有在位點(diǎn)序列旁出現(xiàn)GA或TC，該XbaI位才會(huì)被甲基化。而要解除這種限制修飾作用通常有兩種方法：
?。?）選用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA識(shí)別切割位點(diǎn)與MboI相同；但不受甲基化影響；
?。?）利用甲基化酶缺失的受體細(xì)胞進(jìn)行DNA的制備，如E.coliJM110和鏈霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者細(xì)胞內(nèi)本就沒有甲基化酶，從這些細(xì)胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。