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土壤微生物（細菌、霉菌）實驗原理步驟
閱讀：1039 發(fā)布時間：2023-12-26一、實驗原理：
1.細菌簡單染色
利用單一染料對菌體進行染色的方法叫做簡單染色。
2.細菌的革蘭氏染色
經此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。
3.細菌芽孢染色
首先用著色能力較強的染料，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出。再用對比度大的復染劑（如番紅液）染色后，菌體染上復染劑顏色，而芽孢仍為原來的顏色，這樣就可以將兩者區(qū)別開來。
4.細菌的生理生化實驗
糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應
甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
5.真菌的觀察及鑒定
將培養(yǎng)物直接置于顯微鏡下可觀察到霉菌自然生長狀態(tài)并可連續(xù)觀察不同時期發(fā)育期的菌體結構特征的變化。
二、實驗步驟
1、土壤菌群分離
1.1、滅菌準備
配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基，分別裝入三角瓶中，封好。將內裝 90ml 的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培養(yǎng)基、涂布棒、移液管六支、試管（內裝 9ml 蒸餾水）六支、平皿若干放入滅菌鍋中滅菌。
1.2、梯度稀釋
稱取土壤樣品 10g 加入 90ml 滅菌水中振蕩，直至土壤大顆粒被全打碎，然后靜置 30 分鐘以上，使其澄清。實驗時要保持無菌操作，防止雜菌污染土壤菌液。梯度稀釋是將原液按照十倍的等級進行稀釋，在無菌的條件下，用移液管一取 1ml 上清液加入裝有 9ml 滅菌水試管中振蕩，將其稀釋為 10-1倍，用不同的移液管依次從已稀釋的菌液中取液，將菌液梯度稀釋為原液的 10-1、10-2、10-3、10-410-5倍，分別為-1、-2、-3、-4、-5 梯度，分別表示稀釋原液用 0表示。
1.3、涂布平板
將冷卻至 50-55℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基倒平板，平板固定后進行涂布。在無菌條件下，用對應編號的移液管取菌液加到平板中，然后用涂布棒將其在平板鋪勻。細菌培養(yǎng)基對 0、 -2、 -4、 -5 梯度進行涂布，霉菌培養(yǎng)基對 0、 -3 梯度進行涂布。每梯度涂 3 個平板。
1.4、恒溫培養(yǎng)
將霉菌培養(yǎng)基放入 27℃恒溫箱中培養(yǎng) 3 天，將細菌培養(yǎng)基平板置于 37℃恒溫培養(yǎng) 24 小時。
1.5、菌落統計
對不同梯度的平板進行觀察，選擇合適梯度進行菌落計數，一般每平板 30 個為宜。此次試驗中，細菌培養(yǎng)基上-4 梯度為最佳。霉菌培養(yǎng)基中-3 梯度為最佳。在細菌培養(yǎng)基中，根據菌落形態(tài)的不同選取 5 種菌，考慮到可能有的菌相同，本組選取了6 種菌，對其進行觀察，描述菌落形態(tài)。選擇三種霉菌，對其編號。
1.6、畫線分離
配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基，滅菌（滅菌鍋：山東興華）后倒取平板，將選出的菌進行劃線分離，考慮到菌數多，平板不足，每種菌只劃兩個平板。劃好后分別放入相應恒溫箱中培養(yǎng)。
2、細菌的純化及鑒定
2.1、細菌純化及保藏
配制培養(yǎng)基，在不同菌劃線的培養(yǎng)基中挑取單個菌落進行再次劃線，直至菌種全純化。
制備試管斜面，將菌劃斜面培養(yǎng)留種。
2.2 、細菌形態(tài)觀察
對各菌進行制片，進行單染色觀察其形態(tài)
2.3、革蘭氏染色
為鑒定細菌的革蘭氏反應對菌進行革蘭氏染色，染色前先將進行標準株培養(yǎng)，標準株為大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌），將標準株與純化的八株菌進行培養(yǎng) 12-18 小時，這樣無芽孢的產生，可以防止其影響染色結果。染色完成后進行鏡檢。
2.4、穿刺實驗
穿刺實驗是對菌是否有鞭毛進行鑒定的十分有效的方法。
配制細菌穿刺培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基與細菌培養(yǎng)基大體相同，將其中的瓊脂減少的原來的一半
即為半固體穿刺培養(yǎng)基。
（1）將培養(yǎng)基配好后加熱(微波爐)，使其全融化，略微冷卻后倒入試管中，密封后滅菌。
（2）冷卻固定后，在無菌（超凈工作臺：內循環(huán)風，蘇凈安泰）操作下，用接種針將各菌穿刺接種到半固體培養(yǎng)基中，穿刺時盡量要直，避免劃壞培養(yǎng)基。
（3）將接種好的穿刺培養(yǎng)基放入 37℃的恒溫箱中培養(yǎng) 24 小時。
2.5、細菌芽孢染色
1) 制片
按常規(guī)涂片、干燥、固定。
2) 染色
加數滴 5%孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火（普通酒精燈）上加熱至染料冒蒸汽并開始計時。維持 5min。加熱過程中及時補充染液。切勿讓涂片干涸。
3) 水洗
待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。
4) 復染
用 0.5%番紅染液復染 1.5min 。
5) 水洗
用緩流水洗后，干燥。
6) 鏡檢（普通光學顯微鏡）
先低倍鏡，再高倍鏡，最后油鏡觀察。
2.6、生理生化試驗
（1）配制培養(yǎng)基
分別配制淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基，配制好后放入三角瓶中準備滅菌。配制葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入試管，將其中的德漢氏小管灌滿放入試管。配制蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，配制好后加入試管中，每支試管 1/3 體積培養(yǎng)基，準備滅菌。
（2）接種準備
將培養(yǎng)基貼上標簽包好后放到高壓蒸汽滅菌鍋中，在 121℃滅菌 20 分鐘。滅完菌取出后冷卻，將淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基倒平板。
（3）接種
①在淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基平板背面用標簽筆畫一個十字，將其分為相等的四個區(qū)域，再在相應的位置寫上要種的菌種的編號，在無菌條件下，將菌種分別接在相應的區(qū)域，對于淀粉培養(yǎng)基，在接種時，采取觸點接種，對于脂肪培養(yǎng)基，采取畫十字接種,貼上標簽。
②在無菌條件下，將各菌種分別接在糖發(fā)酵培養(yǎng)基液中，每種菌在葡萄糖和乳糖培養(yǎng)基中各接兩支培養(yǎng)基，每種留一支作為對照，貼上標簽。
③在無菌條件下，將各菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，每種菌分別在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中接兩支培養(yǎng)基試管，貼上標簽。
（4）培養(yǎng)
將接種好的培養(yǎng)基放到 37 攝氏度的恒溫箱中培養(yǎng) 48 小時。
（5）實驗觀察
2.7、確定菌屬
在根據以上實驗結果的基礎上，查詢伯杰氏手冊，確定菌的屬。