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     取適量未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T；G2026-1000T）測蛋白濃度，蛋白樣品在進(jìn)行SDS-PAGE電泳等實驗研究之前要進(jìn)行精確的定量，以保證同一實驗中不同樣品之間上樣量的一致性以及結(jié)果可比性。因此，蛋白濃度測定是研究蛋白中常用、最基本的分析技術(shù)之一。

    BCA原理：在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+結(jié)合生成絡(luò)合物，同時將Cu2+還原為Cu+。BCA試劑可靈敏特異的與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，562nm處有最高的吸收值，可在562nm測定其吸收值，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

蛋白濃度測定方法如下：
1.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液
取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存。

2.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液
取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。

3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）
將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

4.準(zhǔn)備待測樣品
將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測結(jié)果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。

6.檢測
向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)）

7.計算
以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實際蛋白濃度。

提示：
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，建議每次測定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。

4. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。