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ELISA [酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)]原理與分類
【摘要】：1. ELISA 的原理 ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗
相關(guān)專題 ELISA免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù) 1. elisa 的原理
ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
2. ELISA 的類型
ELISA 可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑 "（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；
（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA 主要有以下幾種類型：
2.2.1 雙抗體夾心法測(cè)抗原
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來(lái)源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測(cè)。
在一步法測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成 "夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測(cè)讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg 、AFP 和尿液hCG 等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如 HBsAg 的a 決定簇，也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg 的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問題，HBs Ag 有adr、adw、ayr 、ayw4 個(gè)亞型，雖然每種亞型均有相同的a 決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。
雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（ RF）的干擾。RF 是一種自身抗體，多為IgM 型，能和多種動(dòng)物IgG 的Fc 段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有R F，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。采用F（ab’）或Fab 片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc 段，從而消除RF 的干擾。雙抗體夾心法ELISA 試劑是否受RF 的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)。
雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
2.2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗 HBs 的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。