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撫生試劑- 單克隆抗體的純化
閱讀：136 發(fā)布時間：2014-5-5 單克隆抗體的純化
大量單克隆抗體的方法主要有以下兩種。
1．體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10—60ug／ml，如果大量，費用較高。小鼠可獲5一l0ml腹水。也可用注射器抽提腹水。
2．體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。
(1)實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按(1—3)×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射o．2ml，共2～4點。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20d)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體的含量可達(dá)到1—10rug／m1。但采血量有限。
(2)腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0．5ml降植烷或液體石蠟于BALB／C鼠，1—2周后腹腔注射1X106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10d后可產(chǎn)生腹水。密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡之前處死小鼠，用滴管將腹水吸人試管，一般一只可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5—10mg／ml，這是目前zui常用的方法。還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔，則產(chǎn)生腹水快、量多。
單克隆抗體的純化方法同于多克隆抗體，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前zui有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體(zui常用Sepharose)交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá)90％以上。蛋白可與IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液A280(A)為1．44吸光單位時相當(dāng)于lmg／ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液對保持純化抗體的活性至關(guān)重要。