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心磷脂合酶(CLS)ELISA試劑盒技術(shù)說明

閱讀:100          發(fā)布時間:2015-11-16
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心磷脂合酶(CLS)ELISA試劑盒技術(shù)說明

以 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物(HRP Streptavidin Conjugate,

HRP-SA)為基礎(chǔ),可用于檢測血液,細(xì)胞、組織內(nèi)的特異性 CD40 抗原。該試劑盒

具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰。在所用的 CD40 一抗與相

應(yīng)靶抗原結(jié)合后,用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合,zui后加入 HRP-SA,形成抗

原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 復(fù)合物,顯微鏡下觀察成像。

試劑盒所含試劑:

試劑 A 通透液:0.1% Triton-X 100   10 mL(選用)

試劑 B 封閉緩沖液(封閉用) 20 mL

試劑 C (*分裝)已稀釋的即用型 CD40 一抗(2.5ml)

試劑 D (*分裝)生物素化羊抗兔 IgG 1 支

(濃度 1.5 mg/mL,稀釋比為 1:300~1:500)50 μL+抗體稀釋液 20ml

試劑 E HRP-SA 復(fù)合物 1 支(濃度 1 μM,稀釋比 1:50~1:200)100 μL試劑 F DAB 顯色液 5ml

用戶自備試劑:1. 10mM TBS(pH7.2~7.4)

三羥基氨基甲烷 1.21g

加蒸餾水 800mL,濃鹽酸調(diào) pH 值至 7.2~7.4,zui后定容至 1000mLTBS-T:TBS+Tween 20(0.05%體積比)

2.抗原修復(fù)液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液)10mM pH6.0 檸檬酸緩沖檸檬酸 0.38g檸檬酸三鈉 2.45g加蒸餾水 900mL,濃鹽酸調(diào) pH 值至 6.0,zui后定容至 1000mL或:0.5M EDTA 修復(fù)液(pH8.0)EDTA·2H2O 186.1g蒸餾水 700mL,用 10mM NaOH 調(diào) pH 值至 8.0,zui后定容至 1000Ml

3. 緩沖甘油封固劑 10 mL

4. Tween 20 5 mL 石蠟包埋組織切片免疫染色實驗步驟(建議方案     ):

石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度

1.烤片: 將待做切片置于切片架上,于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr;

2.脫蠟: 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;

3.水化: 切片經(jīng)下行酒精水化,無水乙醇 5min,95%乙醇 2 次(每次 2min),85%乙醇 2 mi75乙醇 2min,自來水沖洗,ddH2O 洗 2×2min;

4.抗原修復(fù): 根據(jù)抗體說明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù),常采用高壓、微波(溫度達(dá)到 98~100℃)或消化修復(fù)法,室溫自然冷卻,自來水沖洗,ddH2O 洗 2×2min,TBS 洗滌(2×2min)(具體修復(fù)方法見附 1)* 注:有些抗原勿需修復(fù),直接進(jìn)入第 5 步封閉。

5.封閉: 滴加試劑 B,37℃濕盒孵育 30 min;

6.加一抗:滴加用試劑 C(即用型一抗),37℃濕盒孵育 2 hr;

7.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min);

8.封閉: 滴加試劑 B,37℃濕盒孵育 10 min;

9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑 D),37℃濕盒中孵育

30 min;

10.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min);

11.封閉: 滴加試劑 Tween 20,37℃濕盒孵育封閉 20 min;

12.加 HRP-SA: 滴加用試劑 C 稀釋的試劑 E(1:50~200,終濃度 5~20 nM),37℃濕盒中孵育 30 min;

13.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min),TBS 洗滌(2×5 min);

14.顯色:應(yīng)用 DAB 溶液(試劑 F)顯色;

15.復(fù)染:自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明;

16.封片: 待組織標(biāo)本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片

17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。

注意事項:

1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,自來水沖洗后方能把切片取出,驟冷有可能導(dǎo)致

結(jié)晶或抗原封閉。

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使

用。

3. 若試劑為微量濃縮液,用前應(yīng)低速離心,將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。

4. 封片前一定要換用 TBS 充分洗滌,以便洗去組織上殘留的 Tween 20,否則會

影響結(jié)果觀察。

5. 如須復(fù)染細(xì)胞核,則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片。

附 1:抗原修復(fù)方法

常用抗原修復(fù)液:檸檬酸緩沖液(0.01M pH6.0)、EDTA 抗原修復(fù)液(pH8.0 或9.0)等等。

一、酶消化修復(fù)法酶消化修復(fù)

切片脫蠟水化處理,TBS 沖洗,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min 后 TBS 沖洗即可。

二、微波抗原修復(fù)法

微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔或繼續(xù)微波 10~15min,取出微波盒冷卻至室溫后,自來水沖洗,取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異,須自行調(diào)整。

三、直接高壓抗原修復(fù)法

取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰,將組織切片置于耐高溫切片架上,修復(fù)液沸騰后放入切片架,蓋上鍋蓋,待噴氣后計時 1.5~2.5min 即可脫離熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。

四、隔水式高壓抗原修復(fù)法

不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰,微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰,將切片放入微波盒中,再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋,待噴氣后計時4~8 min 即可關(guān)閉熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。








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