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                                    ELISA 操作及方法

• ELISA 所需的對(duì)照樣品

• 夾心 ELISA 實(shí)驗(yàn)方案

• ELISA 分析

• 計(jì)算和評(píng)估 ELISA 數(shù)據(jù)

• ELISA 疑難解答提示

選擇適合的方法來(lái)分析 ELISA 數(shù)據(jù)。

ELISA 實(shí)驗(yàn)可根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)類型被分為以下幾類：

• 定性 ELISA 只用于確定樣品中是否有抗原存在。檢測(cè)需要一個(gè)不包含抗原或包含無(wú)關(guān)對(duì)照抗原的空白對(duì)照孔。

• 半定量 ELISA 用于對(duì)樣品間的抗原水平進(jìn)行相對(duì)比較。

• 定量 ELISA 用于計(jì)算樣品中的抗原含量。實(shí)驗(yàn)中需要比較由樣品測(cè)定得到的數(shù)值和由已知濃度純化的抗原梯度稀釋液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這是常用的 ELISA 數(shù)據(jù)。

ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)或校正曲線是定量 ELISA 實(shí)驗(yàn)的要素，它們可用于計(jì)算樣品中抗原的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)繪制已知的參考抗原濃度與每一濃度(通常是450 nm處的光密度)的讀數(shù)之間的關(guān)系得出的。

大部分 ELISA 酶標(biāo)儀將加入用于曲線擬合和數(shù)據(jù)分析的軟件。通過(guò)外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分計(jì)算樣品中抗原的濃度。

圖 1：來(lái)自人 ICAM1 SimpleStep ELISA® 試劑盒 (ab174445) 的定量 ELISA 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的例子。

曲線擬合軟件允許您使用不同的模型繪制您的數(shù)據(jù)。

• 線性圖的一個(gè)坐標(biāo)軸表示抗原的濃度，另一個(gè)表示讀數(shù)。R2 值在此通常用于確定擬合，數(shù)值大于 0.99 表示擬合非常好。然而，線性圖往往會(huì)壓縮曲線下端上的數(shù)據(jù)點(diǎn)，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果不準(zhǔn)。

• 半對(duì)數(shù)圖可以幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對(duì)數(shù)圖使用濃度的對(duì)數(shù)與讀數(shù)的關(guān)系。這種方法通常會(huì)得到數(shù)據(jù)點(diǎn)分布更均勻的 s 形曲線。

• 對(duì)數(shù)/對(duì)數(shù)圖可以為低到中濃度范圍提供良好的線性。但范圍的則容易失去線性。

• 4 或 5 參數(shù)邏輯（4PL 或 5PL）曲線是更為復(fù)雜的方法，考慮了其他參數(shù)比如大值和小值，因此需要更復(fù)雜的計(jì)算。4PL 假設(shè)拐點(diǎn)周圍對(duì)稱，而 5PL 考慮了不對(duì)稱的情況，通常更適合免疫分析。

如果您的軟件允許，則 4-PL 和 5-PL 將適用于大部分 ELISA 校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果您的軟件不允許，則的選擇是使用半對(duì)數(shù)或?qū)?shù)/對(duì)數(shù)圖。