大鼠主動脈外膜成纖維細胞的相關(guān)產(chǎn)品：小鼠牙齦上皮細胞淡紫色擬青霉Paecilomyces lilacinus小鼠牙周膜成纖維細胞棉鈴蟲擬青霉Paecilomycesheliothis(Charles)BrownetSmith小鼠胰島β細胞皮狀絲孢酵母Trichosporoncutaneum(deBeurmetal.)Ota小鼠胰島細胞貝雷絲孢酵母TrichosporonbehrendiiLodde

一、細胞基本屬性：

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代平滑肌細胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

原代細胞實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

公司正在出售的產(chǎn)品：
懸浮中國倉鼠卵巢細胞ExpiCHO

小鼠皮下結(jié)締組織細胞L-WRN（種屬鑒定）
小鼠睪丸上皮細胞15P-1 (種屬鑒定)
人肺腺癌細胞PC-9(STR鑒定正確)
人胚腎細胞ProPakA.6(STR鑒定正確)
人胰腺癌細胞PATU8988S (STR鑒定正確)
人胰腺癌細胞QGP-1(STR鑒定正確)
人宮頸癌細胞熒光素酶標記Hela+luc(STR鑒定正確)
人乳腺癌細胞MDA-MB-231+GFP(STR鑒定正確)
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小鼠結(jié)腸癌帶綠色熒光MC-38+GFP（種屬鑒定）
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人舌鱗癌細胞 CAL 27(STR鑒定正確)
Achromobacter liquefaciens溶膠無色桿菌
Corynebacterium gultamicum棒桿菌
Mycobacterium sp.分枝桿菌
Escherichia coli大腸埃稀氏桿菌
Pseudomonas convexa凸形假單胞菌
Micrococcus lysodeikticus溶壁微球菌
Azotobacter vinelandii維涅蘭德固氮菌
Azotobacter beijerinckii拜氏固氮菌
Azotobacter sp.固氮菌
Azotobacter agilis敏捷固氮菌
大鼠主動脈外膜成纖維細胞Azotobacter vinelandii維氏自生固氮菌
Corynebacterium sp.棒桿菌
Bacillus subtilis枯草芽孢桿菌

Enterobacter aerogenes產(chǎn)氣氣桿菌
Natronococcus zabuyensis扎布耶嗜鹽堿球菌

原代細胞使用方法：

是一種貼壁生長細胞，細胞形態(tài)呈長梭形細胞，在技術(shù)部標準操作流程下，細胞可傳2-3代；建議您收到細胞后盡快進行相關(guān)實驗。

客戶收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出T25細胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 貼壁細胞消化

1)吸出T25細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細胞收貨脫落

1)收集所有細胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)；

4)待細胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預熱)。

5)原瓶內(nèi)貼壁細胞按正常消化處理。

4. 細胞實驗

因原代細胞貼壁特殊性，貼壁的原代細胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實驗器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時，需要對實驗器皿進行包被，以增強細胞貼壁性，避免細胞因沒貼好影響實驗；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細胞種類而定。懸浮/半懸浮細胞無需包被。