大鼠心肌干細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：小鼠晶狀體上皮細(xì)胞熱帶假絲酵母Candida tropicalis (Castellani) Berkhout小鼠精原干細(xì)胞菅囊酵母PachysolentannophilusBoidinetAdzet小鼠口腔上皮細(xì)胞阿拉伯糖醇漢遜酵母HansenulaarabitolgenesFang小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞皺褶假絲酵母Candidarugosa(Anderson)Didden

一、細(xì)胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代心肌干細(xì)胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形細(xì)胞，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
人胃癌細(xì)胞MKN-7(STR鑒定正確)

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(STR鑒定正確)
大鼠肝星形細(xì)胞HSC-T6（種屬鑒定）
人惡性黑色素瘤細(xì)胞WM-115(STR鑒定正確)
小鼠肺癌細(xì)胞系3LL（種屬鑒定）
人卵巢癌細(xì)胞UWB1.289(STR鑒定正確)
小鼠急性骨髓性白血病C1498（種屬鑒定）
人子宮鱗狀癌細(xì)胞SW756(STR鑒定正確)
人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞PL45(STR鑒定正確)
人膀胱鱗癌細(xì)胞SCaBER(STR鑒定正確)
小鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞GT1-7（種屬鑒定）
人前列腺癌細(xì)胞PC-3M(STR鑒定正確)
人膀胱癌細(xì)胞RT-112(STR鑒定正確)
大鼠肝間質(zhì)細(xì)胞
人小細(xì)胞肺癌 DMS-153 (STR鑒定正確)
Rhodopseudomonas sp.紅假單胞菌
Rhodocista pekingensis北京紅簍菌
Rhodobium marinum海紅菌
Bifidobacterium catenulatum鏈狀雙歧桿菌
Halorubrum trapanicum特臘帕尼鹽紅菌
Natrialba asiatica中亞無色需堿菌
Bifidobacterium longum subsp. infantis長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種
Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum假長(zhǎng)雙歧桿菌球形亞種
Halorubrum sodomense所多瑪鹽紅菌
Aeromonas veronii維羅納氣單胞菌
大鼠心肌干細(xì)胞Bifidobacterium bifidum雙歧雙歧桿菌
Propionibacterium acidipropionici產(chǎn)丙酸丙酸桿菌
Bifidobacterium breve短雙歧桿菌
Bifidobacterium animalis subsp. lactis動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii費(fèi)氏丙酸桿菌舍氏亞種