兔肝外膽管上皮細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：魚鰓細(xì)胞系 RTgill-W1 (ATCC CRL-2523)柱銹耳屬Eocronartium sp.人肝星形細(xì)胞帶紅色熒光LX-2+RFP(STR鑒定正確)柱孢霉屬Cylindrocarpon sp.人腎癌細(xì)胞A-498(STR鑒定正確)錐毛殼屬Coniochaeta sp.人神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌細(xì)胞NCI-H660竹波鏈霉菌Streptomyces tsukubae

一、細(xì)胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石狀細(xì)胞，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶內(nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，需要對實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
小鼠腎足細(xì)胞；Mousepodocyte

人肺粘液上皮樣癌細(xì)胞；NCI-H292
人侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞；MuM-2C
人低侵襲性脈絡(luò)膜黑色素素瘤細(xì)胞；OCM-1A
人胚肝二倍體細(xì)胞；CCC-HEL-1
小鼠淋巴瘤細(xì)胞；P388D1(IL-1)
人胃腺癌細(xì)胞；SGC-7901[SGC7901]
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞；ZR-75-30
綠色熒光蛋白標(biāo)記小鼠子宮頸癌細(xì)胞；U14-GFP
人急性T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞；I2.1(CRL-2572)
人膀胱癌細(xì)胞；5637（HTB-9）
人低分化肺腺癌細(xì)胞；SK-LU-1
小鼠子宮頸癌細(xì)胞；U14
人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞；786-O[786-0]
人胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞；CFPAC-1
星座鏈球菌星座亞種Streptococcus constellatus subsp. constellatus
杏鮑菇Pleurotus eryugii (DC.:Fr.) Quel.
熊蜂生假絲酵母Candida bombicola
休哈塔假絲酵母Candida shehatae H.R.Buckley&Uden
繡球菌Sparassis crispa (Wulfen) Fr.
需血斯尼思氏菌基因組DNAGenomic DNA from Sneathia sanguinegens
懸鉤子農(nóng)桿菌Agrobacterium rubi
雪腐鐮刀菌Microdochium nivale
血紅密孔菌Trametes sanguinea
血紅栓菌Trametes│sanguinea (L.) Lloyd
兔肝外膽管上皮細(xì)胞血鏈球菌Streptococcus sanguinis
血液分枝桿菌Mycobacterium septicum
蕈狀芽孢桿菌Bacillus mycoides
蕈狀芽胞桿菌Bacillus mycoides
鴨沙門氏菌Salmonella anatum