制備細(xì)胞懸液：

對于貼壁生長的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落

根據(jù)需要加入合適體積的培養(yǎng)基，將細(xì)胞進行中和及稀釋，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹打散開，不要殘留任何細(xì)胞團

 

準(zhǔn)備血細(xì)胞計數(shù)器：

使用70%乙醇將蓋玻片和血細(xì)胞計數(shù)器清潔干凈

將將蓋玻片潤濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細(xì)胞計數(shù)器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細(xì)胞計數(shù)器上

 

臺盼蘭染色（可選）：

如果需要計算細(xì)胞的活力，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合

室溫孵育3-5分鐘，使臺盼蘭*進入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍色

 

血細(xì)胞計數(shù)器加樣：

使用吸管將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺盼蘭混合液滴加到血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數(shù)池

以同樣的方式在另一側(cè)的計數(shù)池中也加入細(xì)胞懸液

將計數(shù)板放置幾分鐘使細(xì)胞*擴散，同時用吸水紙吸除多余的液體

 

細(xì)胞計數(shù)：

在100倍顯微鏡下，移動計數(shù)板將視野對準(zhǔn)計數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個視野（右上圖中標(biāo)記的3號位置）

使用手持式計數(shù)器記錄計數(shù)池四個角以及中央方塊內(nèi)的細(xì)胞數(shù)（1-5號位置，經(jīng)典的current-protocol推薦每個方塊細(xì)胞數(shù)應(yīng)不大于20-50），并重復(fù)記錄另一側(cè)計數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計十個方塊。計數(shù)的方法是只計算上邊和左邊壓線的細(xì)胞，而右邊和下邊壓線的細(xì)胞不予計算（下圖，總體原則是“計上不計下，計左不計右”，判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個細(xì)胞沒有吹散成團存在，此時只可記為一個細(xì)胞。如果團塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個細(xì)胞，

計算細(xì)胞數(shù)：

 

 

由血細(xì)胞計數(shù)器的構(gòu)造可以看出，血細(xì)胞計數(shù)器每個大方塊可以容納的體積為：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 cm3 = 10-4 ml

也即每個大方塊的體積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時需要乘以104。

 

在常規(guī)沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升培養(yǎng)基中細(xì)胞的個數(shù)：

 

每毫升培養(yǎng)基中細(xì)胞的個數(shù) = 每個方塊內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋比例 × 104

 

如何使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細(xì)胞的比率：

 

活細(xì)胞比率 = 臺盼蘭拒染細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù)

此時細(xì)胞數(shù)的計算公式為：

 

每毫升培養(yǎng)基中活細(xì)胞的個數(shù) = 每個方塊內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 活細(xì)胞比率 × 細(xì)胞稀釋比例 × 2 × 104

 

注：乘2是由于在臺盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。