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神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)指南——B27

閱讀:749      發(fā)布時間:2023-11-14
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概念——Mckay于1997年在《Science》雜志上將神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的概念總結(jié)為:具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力,能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞,神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)理論。


圖1 第3、5、7代神經(jīng)球巢蛋白免疫熒光染色(×400)免疫熒光染色陽性圖片

 

特點(diǎn)——過對稱分裂和不對稱分裂兩種分裂方式完成自我更新,NSCs具有多向分化潛能,且不表達(dá)成熟抗原,不被免疫系統(tǒng)所識別,能通過血腦屏障,可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合,在宿主體內(nèi)長期存活。

 

應(yīng)用——神經(jīng)干細(xì)胞能夠趨向損傷部位,通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子或者分化為不同的細(xì)胞修復(fù)或補(bǔ)充受損神經(jīng)組織,神經(jīng)干細(xì)胞還可以作為基因載體,用于顱內(nèi)腫瘤和其它神經(jīng)疾病的基因治療,此外,體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可用于判斷藥效及藥物毒性,例如觀察某些化合物的神經(jīng)活性。目前美國臨床信息公示數(shù)據(jù)庫中,NSCs相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)共有122例,涉及到了多發(fā)性硬化、帕金森病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、脊髓損傷等。

 

不對稱分裂:一種細(xì)胞分裂的方式,母細(xì)胞產(chǎn)生的兩個子細(xì)胞的類型各不相同。相反,對稱性分裂就是產(chǎn)生兩個相同的細(xì)胞。

 

神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)——許多研究表明采用無血清培養(yǎng)基,NSCs 可以穩(wěn)定在未分化狀態(tài),而采用含血清培養(yǎng)基,NSCs 多數(shù)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。

 

B-27添加劑(50×,不含維生素A)abs9272是無血清添加劑,包含抗氧化劑、神經(jīng)細(xì)胞所需生長因子、維生素(不含維生素A)和神經(jīng)元所需的脂肪酸等,以適宜比例配比,可應(yīng)用于大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。無維生素 A型可防止干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化,是神經(jīng)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)不能少的試劑。推薦搭配神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基(abs9460)進(jìn)行培養(yǎng)。 由于L-谷氨酰胺在水溶液中不穩(wěn)定,神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基和B-27中都未包含L-谷氨酰胺,因此在配制培養(yǎng)基時須另外添加L-谷氨酰胺。



圖2 不同類型培養(yǎng)基(×100)形成4d神經(jīng)球的比較

A:無血清培養(yǎng)基含有B27(2%)原代培養(yǎng)4d;B:含血清培養(yǎng)基原代培養(yǎng)4d

 

培養(yǎng)基配置方案

 

1、置于4°C解凍本產(chǎn)品;
2、在使用前無菌添加2%本產(chǎn)品和5mM L-谷氨酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基,配制成神經(jīng)元培養(yǎng)基注意:剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積,并儲存在-20℃。避免反復(fù)凍融;
3、對于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng),神經(jīng)元培養(yǎng)基(由前述步驟制備)需要額外補(bǔ)充25μM的L-谷氨酸,在培養(yǎng)4天以后不再額外添加谷氨酸。配置好的培養(yǎng)基,可于2-8℃的避光可保存一周。


圖3 B-27添加劑(50×,不含維生素A) abs9272

 

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

 

1、用預(yù)冷的0.05mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)皿表,每平方厘米表面使用0.15mL,室溫包被1h;
2、去除多聚賴氨酸溶液,并用無菌蒸餾水沖洗(多聚賴氨酸對細(xì)胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)皿的蓋子通風(fēng),直到干燥。培養(yǎng)皿干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周;
3、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序或隨細(xì)胞提供的說明書分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元;
4、在預(yù)熱的(37℃)神經(jīng)元培養(yǎng)基中(如前所述的方法制備) 接種細(xì)胞,建議的細(xì)胞密度為160個細(xì)胞/平方毫米, 或必要時使用自行優(yōu)化的細(xì)胞密度;
5、在37℃,含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng);
6、培養(yǎng)4-24h后, 更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
7、對海馬神經(jīng)元以外的細(xì)胞:在接種4d后,更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基,之后每3d重復(fù)一次。 


對海馬神經(jīng)元:接種3d后,用不含L-谷氨酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每3d重復(fù)一次。 


注意:在培養(yǎng)基中添加25µM 2-Mercaptoethanol,可改善海馬神經(jīng)元的長期存活率。 

 

其他神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加物

 

除B27(50×,不含維生素A)外,含維生素的B27(abs9120)、N-2無血清添加劑(100×)(abs9121),以及馬血清在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用都較為廣泛。

 

區(qū)別在于:N-2無血清添加劑是化學(xué)成分確定的添加劑,N-2 添加劑主要被推薦用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)來源的有絲分裂后期的神經(jīng)元的生長和表達(dá)。B-27添加劑(50×)用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長和保持其短期或長期活性。其中不含維生素A款,可防止干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化,更適合神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖。很早之前就有研究人員對比過不同種類血清對神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于胎牛和其他動物血清,馬血清(abs989)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖的作用顯著,與胎牛血清相比,馬血清用于培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞,具有非常高的性價比。

 

胞胞巴適本期推薦:


貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

abs9272

B-27添加劑(50X,不含維生素A)

10mL

abs9120

B-27添加劑 (50×)

10mL

abs9121

N-2 無血清添加劑(100×)

5mL

abs989

馬血清(優(yōu)級)

500mL

abs9460

神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含 L-谷氨酰胺)

500mL

abs9561

DMEM/F-12培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺,含丙酮酸鈉,含HEPES)

500mL

abs42155907

多聚L-賴氨酸溶液

100mL





參考文獻(xiàn)


[1] 吳增,李媛,靳曉飛等.神經(jīng)干細(xì)胞提取與培養(yǎng)方法的比較研究[J].中國藥理學(xué)通報,2018,34(05):729-734.

[2] 于麗華,趙書平,席先成等.不同種類血清對新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2002(03):190-192.

 

注:文中圖片來自網(wǎng)絡(luò)或參考文獻(xiàn),僅供學(xué)習(xí)參考用


 

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Absin特色產(chǎn)品線:

WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

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