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胰腺癌是一種毀滅性的疾病。在過去的幾十年里，這種癌癥的5年總生存率仍然不足5%，未發(fā)生較大變化，目前它是西方國家癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。手術(shù)仍然是有可能治愈這種癌癥的方法，但只有約20%的患者在診斷時處于手術(shù)可切除的疾病階段。在先進的治療方法下，手術(shù)可切除的患者的中位總生存期為26個月，然而已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的中位總生存期為不到6個月。因此，對新治療方案的需求尚未得到滿足。嵌合抗原受體（CAR）T細胞（CAR-T）是一種新的有前途的治療方法。對胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）進行有效細胞免疫治療的一個主要障礙是缺乏合適的腫瘤特異性抗原。

在一項新的研究中，德國研究人員進行了經(jīng)驗性篩選旨在發(fā)現(xiàn)治療PDAC的CAR候選靶標，確定了四個候選靶標：CLA、TSPAN8、CD66c和CD318。他們發(fā)現(xiàn)CLA在上皮性腫瘤上表達。

到目前為止，CLA只被認為是一種*的皮膚歸巢受體，在T細胞、B細胞、NK細胞、朗格漢斯細胞、單核細胞和樹突狀細胞的亞群中表達。它是SELPLG蛋白的一種特殊的糖基化形式，通過與E-選擇素、L-選擇素和P-選擇素結(jié)合在免疫細胞的組織浸潤中起作用。由于它只在這些細胞類型的亞群上表達，這些作者推測它可能是一個合適的CAR-T細胞靶標，具有可接受的腫瘤外毒性。然而，由于它的表達在活化的T細胞上發(fā)生上調(diào)，它構(gòu)成了產(chǎn)生功能性CAR-T細胞的一個技術(shù)障礙。CLA特異性CAR-T細胞的表現(xiàn)更差，這凸顯了CAR-T細胞對自身抗原特異性的內(nèi)在問題?？茖W(xué)家們?yōu)檫@個問題開發(fā)了潛在的解決方案。一些人建議用CRISPR/Cas介導(dǎo)的方法敲除T細胞內(nèi)的抗原，另一些人則主張利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留結(jié)構(gòu)域與自身抗原特異性的scFv結(jié)合，將自身抗原捕獲到T細胞中。

其他確定的候選靶標CD66c、CD318和TSPAN8已被描述為在一些癌癥實體中過度表達。結(jié)合這些作者的抗體驅(qū)動的篩選、全面的生物信息學(xué)分析和免疫熒光分析，他們增加一個重要的知識，即這些候選靶標的表達不僅在PDAC腫瘤細胞中高度富集，而且在人體中的腫瘤外表達也受到限制。這種方法的有效性的一個強有力的支持是，他們確定了已經(jīng)用于CAR-T細胞治療的靶標，如CEACAM5（CEA）或PROM1（CD133）。

鑒定PDAC CAR候選靶標，

這些作者在體外評估了32種在scFv定位和間隔區(qū)長度上存在差異的CAR構(gòu)建體。對CD318和CD66c而言，較短的間隔區(qū)顯示出最高的功能性，而基于較長間隔區(qū)的TSPAN8特異性CAR構(gòu)建體表現(xiàn)更好。CD318具有最長的細胞外氨基酸鏈（638），其次是CD66c（320）和TSPAN8（24和96）。盡管對scFvs的確切表位和細胞外結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)缺乏了解，但是這些發(fā)現(xiàn)很好地與以前的調(diào)查相吻合，指出較長的間隔區(qū)對膜近端表位有優(yōu)勢，反之亦然。

此外，這些作者發(fā)現(xiàn)，在兩個獨立的臨床前研究中，他們的四種體外表現(xiàn)*CAR構(gòu)建體也表現(xiàn)出了抗腫瘤的功效。CD318 XS Vh-Vl CAR和TSPAN8 S Vh-Vl CAR被證實是非常有前途的候選CAR，基于它們的高效力，可以進一步進行臨床前評估和潛在的臨床評估。在兩種異種移植模型的一種中，CD66c S Vl-Vh CAR在體外療效方面要落后些，但仍能誘導(dǎo)疾病穩(wěn)定。

這些作者發(fā)現(xiàn)CD66c特異性CAR-T細胞的活性下降不是由于靶標下調(diào)引起的，而且脾臟中的CAR-T細胞數(shù)量與其他治療組無關(guān)，因此排除了持久性這個問題。在腫瘤部位，他們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞和CAR-T細胞的浸潤減少，這表明CAR-T細胞的浸潤和潛在激活可能受到損害。其他研究已表明，抗原非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（tonic signaling）可導(dǎo)致體外和體內(nèi)研究中的這種差異。然而，他們沒有觀察到與靶標陰性細胞共培養(yǎng)的CAR-T細胞的背景激活。當改用基于CD66c XS的CAR構(gòu)建體時，他們發(fā)現(xiàn)這種CAR構(gòu)建體在體內(nèi)的表現(xiàn)更出色，盡管在體外只觀察到微小的差異。一個主要的區(qū)別是就XS構(gòu)建體而言，IL-2和其他細胞因子的釋放更出色。據(jù)觀察，IL-2的產(chǎn)生表明有一種適當?shù)墓δ苄怨泊碳そY(jié)構(gòu)域。此外，IL-2在實現(xiàn)共刺激信號對T細胞生存、增殖和體內(nèi)持久性的積極作用中起著關(guān)鍵作用。

在可能的臨床轉(zhuǎn)化方面，這些作者發(fā)現(xiàn)CD66c和CEA的重疊表達，使其成為一個有趣的候選靶標。事實上，已經(jīng)證明CD66c比CEA在惡性組織中更多地過度表達。這一發(fā)現(xiàn)可能有助于制造微調(diào)的CAR，以便能夠區(qū)分腫瘤細胞和健康細胞的不同表達水平。然而，CD66c在中性粒細胞和其他髓樣細胞上的表達水平凸顯了通過血液中大量的CAR-T細胞反應(yīng)性誘發(fā)嚴重的細胞因子釋放綜合征（CRS）的風(fēng)險，這在用CD19特異性CAR-T細胞治療的B-ALL患者中觀察到，特別是在腫瘤負荷高的患者中。

然而，雖然CRS和B細胞增生可以得到很好的治療，但中性粒細胞減少只能在一個很短的時間窗口內(nèi)被容忍，這使得CD66c成為一種高風(fēng)險的靶標，至少在單靶標特異性的CAR-T細胞方法中是如此。使用布爾邏輯門控（比如AND或NOT CAR構(gòu)建體）的組合方法可能會提供一個替代方案來規(guī)避預(yù)期的毒性。這些作者發(fā)現(xiàn)與CD318的組合可能是他們的候選靶標中的*。在這方面，已有的靶標（如MSN或CD133）和這項研究描述的靶標的組合，也將擴大特異性靶向胰腺腫瘤細胞的CAR庫。進一步的替代選擇是開發(fā)區(qū)分腫瘤細胞和健康細胞表面上抗原表達水平的CAR，或者嚴格控制結(jié)合物的給藥時間和劑量的CAR，如抗FITC引導(dǎo)的CAR或UNI-CAR。此外，對CAR表達或激活進行空間控制可能進一步增加安全性。這些方法有可能克服在單一靶標特異性CAR-T細胞中觀察到的在靶腫瘤外毒性（on-target off-tumor toxicities，即脫靶毒性）。

CD318和TSPAN8已被提出作為藥物療法或抗體驅(qū)動療法的靶標。雖然之前的研究已顯示體外和體內(nèi)的腫瘤增長率下降或疾病穩(wěn)定，但這些作者的結(jié)果顯示腫瘤被**，這很可能歸于代表“活體藥物”的T細胞的細胞毒性。在B細胞惡性腫瘤中，這一點已被證明，即在先前的CD19特異性抗體治療失敗后，通過CD19特異性CAR-T細胞的施用實現(xiàn)了疾病的*緩解。然而，由于CAR-T細胞比抗體更有效，而且其藥代動力學(xué)難以預(yù)測和控制，因此必須謹慎管理，以應(yīng)對潛在的腫瘤外毒性。他們旨在預(yù)測組織面臨風(fēng)險的分析表明，CD318具有最有利的模式，在健康組織中幾乎沒有檢測到這種蛋白的表達。根據(jù)他們的結(jié)果，預(yù)測TSPAN8特異性毒性的最高風(fēng)險發(fā)生在胃腸道，特別是結(jié)腸，可能與靶向CEA的CAR所觀察到的相似。與CEA類似，使用另一種CAR-T細胞輸注途徑進入肝動脈可能是克服這種潛在健康威脅的一個解決方案。此外，使用AND CAR策略有可能進一步減少對結(jié)腸組織的毒性，CAR-T細胞只有在遇到CD318和TSPAN8時才被激活。

當然，除了安全性之外，療效也必須在臨床上得到證明。這些作者發(fā)現(xiàn)，只有靶標陽性的腫瘤細胞才能誘導(dǎo)T細胞激活。這些候選靶標在人源腫瘤異種移植模型和原發(fā)性PDAC上偶爾表現(xiàn)出不同的表達模式，這可能反映了PDAC的不同遺傳背景。然而，這與以前的PDAC CAR靶標無關(guān)。這就提出了對預(yù)測療效的配套診斷工具的需求。最有可能的是，在患者活組織檢測中測得的靶標表達將在這種高度個性化方法的未來發(fā)揮核心作用，這篇論文描述的循環(huán)免疫熒光（cyclic Immunofluorescence）方法可以幫助對患者進行分層。

在靶向CD19的CAR療法中，盡管最初檢測到靶標表達下調(diào)或丟失，但仍可能導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。腫瘤通過抗原逃逸產(chǎn)生治療抵抗性的風(fēng)險取決于靶分子的生物學(xué)功能，它決定了腫瘤獨立于靶分子的難易程度。在這項新的研究中，這些作者沒有直接分析靶細胞丟失作為一種抵抗性機制的概率，盡管他們在體內(nèi)模型中沒有觀察到這種效應(yīng)。然而，由于與人類腫瘤治療相比，小鼠實驗的時間跨度有限，這可能會被忽略，就像CD19的情況一樣。以前的大量研證實了CD66c、CD318和TSPAN8對癌癥的侵襲性和傳播起著關(guān)鍵作用。然而，它們是否對腫瘤細胞的生存至關(guān)重要，特別是對PDAC而言，仍然不清楚。這進一步強調(diào)了多靶標可用性的必要性，允許聯(lián)合治療，從而通過增加對腫瘤細胞的選擇性壓力來減少靶標陰性疾病復(fù)發(fā)（target-negative relapse）的風(fēng)險。

對CAR-T細胞的體外靶標特異性激活和對CD66c XS CAR進行體內(nèi)評價，

總之，這項研究將基于經(jīng)驗的抗體流式細胞儀篩選與循環(huán)免疫熒光成像平臺相結(jié)合，并對腫瘤外表達進行了全面的生物信息學(xué)和實驗評估，以確定PDAC特異性細胞表面標志物。這些作者確定了四個候選靶標，即CLA、CD66c、CD318和TSPAN8，以便通過CAR-T細胞對PDAC進行可能的細胞免疫治療。CD66c特異性CAR、CD318特異性CAR和TSPAN8特異性CAR在體外和體內(nèi)都顯示出功能，其中CD318是最有利于臨床轉(zhuǎn)化的候選靶標