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【目的】

掌握BCA法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。

 

【原理】

BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他 試劑 組成的 試劑 ，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將Cu2+ 還原為Cu+ ，一個Cu+ 螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。

 

【操作】

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取 試管 七支、編號，按下表操作：

 

【計算】

（一） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（二） 以測定管吸光度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。

（三） 再從標(biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出待測血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。

 

【優(yōu)缺點】

(一) 操作簡單，快速，45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；

(二) 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。

(三) 經(jīng)濟(jì)實用，除 試管 外，測定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；

(四) 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無影響

 

【器材】

（一） 7220型分光光度計

（二） 恒溫 水浴 箱

（三） 中試管7支

（四） 槍式移液管

 

【試劑】

1、 試劑A：1％BCA二鈉鹽

2％無水碳酸鈉

0.16%酒石酸鈉

0.4％氫氧化鈉

0.95％碳酸氫鈉

混合調(diào)PH值至11.25。

2、 試劑B：4％硫酸銅。

3、 BCA工作液：試劑A 100ml ＋ 試劑B 2ml混合

4、 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：用結(jié)晶牛 血清 白蛋白根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（純度可經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量而確定）

5、 待測樣品：用雙縮脲測定法的樣品稀釋而成。