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滬鼎生物|血細胞五分類測定常用技術以及技術的原理
閱讀：620 發(fā)布時間：2024-3-22血細胞分析儀是醫(yī)院臨床檢驗應用非常廣泛的儀器之一，是指對一定體積內血細胞數量及異質性進行分析的儀器。隨著電子技術、流式細胞技術、激光技術、電子計算機技術和新熒光化學物質等各種高新技術在血細胞分析儀中的應用，使血細胞分析儀的檢測原理不斷完善、測量參數不斷增加、檢測水平不斷提高，尤其在白細胞五分類技術方面，已發(fā)展到可利用多項技術聯(lián)合(如射頻、細胞化學染色、流式細胞術和熒光染色技術等)，同時檢測一個白細胞再用先進的計算機技術區(qū)分、辨別，經上述方法處理后的各自細胞間的細胞差別。綜合分析實驗數據，得出較為準確的白細胞分類結果，為臨床疾病的診斷、治療提供了重要的實驗室依據。近年來，可以對白細胞進行五分類計數的血細胞分析儀已經普遍使用。下面就為大家介紹目前血細胞五分類測定中常用技術及技術原理。
血細胞五分類技術的原理
1. 流式細胞術(flow cytometry，FCM)
流式細胞術是一種綜合應用光學、機械學、流體力學、電子計算機、細胞生物學、分子免疫學等學科技術，使被測溶液流經測量區(qū)域，并逐一檢測其中每一個細胞的物理和化學特性，從而對高速流動的細胞或亞細胞進行快速定量測定和分析的方法。
①.待測細胞經處理或染色后被壓入流動室，與此同時，不含細胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)域，在激光束的照射下產生散射光和激發(fā)熒光，這兩個光源信號分別反映了細胞體積的大小和內部的信息，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模，數轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號，經計算機處理，可將分析結果顯示在屏幕上。
②.為了保證細胞單個排列地逐一通過檢測區(qū)域，鞘流技術在流式細胞術中被廣泛應用。根據層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同，所以在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動中可以保持相互分離并且同軸。同時鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動并迫使他們的流動軌跡保持在液流的中軸線上，使細胞單排列地逐一通過檢測區(qū)域，這便是所謂的液流聚焦原理
2. 阻抗法
根據庫爾特原理，將不良導體血液按一定比例稀釋于等滲的電解液中，在小孔電極的兩側加一恒流源在負壓作用下，使稀釋的血細胞通過小孔，當細胞通過截面時會由于電阻增大產生相應的脈沖，其脈沖的幅度與細胞的體積成正比，脈沖的頻度與細胞的數量成正比。利用庫爾特原理可以有效地區(qū)分淋巴及單核細胞。
3. 激光散射法／多角度偏振光散射技術
①.根據光散射理論，當激光照射到流動室內流過的每一個細胞時，由于細胞的物理特性，部分光線從細胞上經不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強可以反應細胞體積；大角度散射光的光強可以反應細胞核，漿復雜度和細胞顆粒的信息；而側向散射光的光強可以反應細胞膜、核膜、細胞質的變化。因此，可以依據細胞表明光散射的特點對細胞進行分類。用激光光源產生的單色光束直接進入計數池的敏感區(qū)，在不同角度(10度~70度)對每個細胞進行掃描分析，測定其散射光強度，從而提供細胞結構、形態(tài)的光散射信息。由于粗顆粒細胞的散射強度比細顆粒細胞更強，故光散射對細胞顆粒的構型和顆粒質量具有很好的區(qū)別能力。
②.多角度偏振散射技術用偏振激光束射照單個排列細胞，并進一步分辨細胞。該技術采用了10度窄角和偏振加消偏振檢測法，分辨能力有所提高。它首先測試中性，單核細胞，用0度～90度的散射數據，再測得90度的衍射差，將嗜酸性和中性細胞分開，而嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞則按其大小和內部結構不同的復雜性，所產生的散射光也各異，用可調較的門限加以區(qū)分。其采用特定程序自動儲存分析數據，并經計算機軟件處理，在屏幕上顯示6個散點圖和2個直方圖。
4. 各種細胞化學特性應用技術
利用五種白細胞自身不同的化學性質，應用相應的化學試劑加以區(qū)分，由于嗜酸性(或嗜堿性)粒細胞均有較強的堿性(酸性)，因此在特殊的溶血劑作用下，經過特定時間及溫度的孵育，可使除嗜酸性(嗜堿性)粒細胞之外的所有細胞溶解或wei縮，經處理之后的細胞根據阻抗脈沖計數法，可得相應嗜酸性(嗜堿性)細胞有效數值。
利用五種白細胞過氧化物酶活性的差異對白細胞進行染色，測定其酶反應強度，對白細胞進行分析。血液中五種白細胞的過氧化物酶活性排列順序為：嗜酸性粒細胞>中性粒細胞>單核細胞。淋巴細胞和嗜堿性粒細胞均無過氧化物酶。將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內經孵育，再加入過氧化氫和四氯一萘酚，細胞內過氧化酶分解產生氧離子，使四氯一萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應部位。根據酶反應強度的不同，利用光電檢測技術測定相應吸光度值的方法,用以區(qū)分嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞。
5. 熒光法
利用不同細胞的細胞膜、胞內因子以及胞內DNA、RNA、胞內離子鈣等不同染色特性，選用具有特異性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細胞分別標記相應的熒光物質，經過特定波長的激光照射激發(fā)出不同波長的熒光，利用各種PMT管檢測熒光信號的個數，可以完成待檢細胞的計數，如進一步分析計數淋巴細胞或網織紅細胞等。
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