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酶聯(lián)免疫檢測中：ELISA試劑盒操作要點
閱讀：1381 發(fā)布時間：2018-2-26在進行酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實驗中，有很
多需要注意的地方，由于ELISA方法廣泛應(yīng)用在各種抗原和抗體的此定中。但是測定中的影響
因素很多，并且對操作有較高的要求，所以，在實驗中除了正常的相互反應(yīng)，還會出現(xiàn)錯誤的
反應(yīng)，導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。
而造成這種錯誤的可能因素有：標(biāo)本因素；試劑因素；操作因素等。
為此，本司針對常見問題做分析如下：
ELISA 試劑盒標(biāo)準操作要點
無論在什么研究中，的試劑、良好的和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準確可靠
的必要條件。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的純化
水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。
A 標(biāo)本的采取和保存
大部分ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，
紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可
能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性
HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中
保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。
凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼?/p>
血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)
本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。
保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。
抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑
。
B 加樣
加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
C 保溫
在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1
-2小時，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板
孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力
求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育
中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
D 洗滌
洗滌在ELISA試劑盒過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA就是
靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相
抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯
等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。
可以說在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴格
按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離
子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從
而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水
溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在
0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率
在1.5us/cm之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40秒左右，孔內(nèi)
液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。
E 顯色和比色
TMB經(jīng)HRP 作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可*消退至
無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這
類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各
類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標(biāo)比色
儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測
讀速度、讀數(shù)的準確性、重復(fù)性、度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可
到0.001，準確性為±1%，重復(fù)性達0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時
室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。
測讀A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長
式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次
測定間不 移動ELISA 板的位置，終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少
由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。