化工儀器網(wǎng)技術(shù)文章
BCA 蛋白定量試劑盒說明書
閱讀：8777 發(fā)布時間：2020-11-5BCA 蛋白定量試劑盒
產(chǎn)品簡介：
目前世界上的蛋白濃度檢測方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay
Kit)和 Bradford 蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA 法與傳統(tǒng)方法相比更
簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。BCA 法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成
分的影響，對于 5%以內(nèi)的 SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80 具有很好的兼容
性,但 BCA 法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在 BCA 法測定蛋白濃
度前應(yīng)盡量使：EDTA 濃度≤m10M，DTT 濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。
在 50～1000μg/ml 濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，
其小檢出量為 25μg/ml。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
產(chǎn)品組成：
自備材料：
1、酶標(biāo)儀或分光光度計
2、96 孔板或 EP 管
3、恒溫箱或水浴鍋
操作步驟(僅供參考)：
1、取 1ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液*加入到含有 20mg 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)中，充分溶解后配制成
20mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃保存。
2、取適量的 20mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為 500μg/ml 或所需濃度。如取 25μ
l 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mg/ml)，加入 975μl 稀釋液，充分混勻即配制成 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶
液。注意：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，
一般可用 0.9%NaCl 或 PBS 作為溶解 BSA 稀釋液，稀釋后的 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液
也應(yīng)-20℃長期保存。
3、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(A):試劑(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液，即取 50 份 BCA 試
編號
名稱
250T
500T
2500T
Storage
試劑(A): BCA 試劑 A
50ml
100ml
500ml
RT 避光
試劑(B): BCA 試劑 B
1.5ml
3ml
15ml
RT
試劑(C): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)
20mg
20mg
20mg
RT
試劑(D): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液
5ml
10ml
10ml
RT
使用說明書
1 份
BCA Protein Assay Kit
HLPT0001
HLPT0001
HLPT0001
上海哈靈生物科技有限公司劑 A 和 1 份 BCA 試劑 B，充分混勻，即獲得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液應(yīng)為
蘋果綠或墨綠色，如變?yōu)樽仙蚱渌伾珣?yīng)棄用)。例如取 5ml BCA 試劑 A 和 0.1ml BCA
試劑 B，配制成 5.1ml BCA 工作液，BCA 工作液室溫 24 小時內(nèi)穩(wěn)定。
4、將 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按 0、1、2、4、8、12、16、20μl 加到 96 孔板或 EP 管中，
加稀釋液補(bǔ)足至 20μl，其蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度依次為 0、25、50、100、200、300、400、
500μg/ml。
5、加 20μl 待測蛋白到 96 孔板或 EP 管中，如果樣本不足 20μl，用稀釋液補(bǔ)足至 20μl。
注意：如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應(yīng)在待測蛋白中加入 20μl 稀釋
液；如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液相同，無需在待測蛋白孔中加入 20μl 稀
釋液，以減少不同溶液的差異。
6、向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液，37℃孵育 20～30min。
7、酶標(biāo)儀或分光光度計測定 562nm 波長處吸光度(如無 562nm，540～595nm 之間的波
長也可)，各孔或 EP 管吸光度減去未加 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以求得的差
值為縱坐標(biāo)：以標(biāo)準(zhǔn)孔或 EP 管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。
注意事項(xiàng)：
1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)粉末溶解于蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液后，即獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液(即 20mg/ml 的蛋
白標(biāo)準(zhǔn))，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測，該蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液-20℃長期保存。
2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測
蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確。
3、如果檢測效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顏色會隨著時間的延長不
斷加深，顯色反應(yīng)也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當(dāng)延長孵育時間或在
較高溫度下孵育。
4、測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化，可能的原因是
樣品中含有嚴(yán)重干擾 BCA 法測定蛋白濃度的物質(zhì)。
5、BCA 法檢測時，待測樣本中不應(yīng)含有 EGTA，否則影響檢測結(jié)果。
6、因 BCA 法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，建議每次測定時都作標(biāo)準(zhǔn)曲線，且
顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，否則每次都做
標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7、如果沒酶標(biāo)儀，也可用普通分光光度計測定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的小測定體積，應(yīng)
按比例適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用
量亦相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計測定蛋白濃度時，可以測定的樣品數(shù)量可能會顯
著減少，建議把系列標(biāo)準(zhǔn)品用量增加至 100μl，BCA 工作液用量增加至 1ml。
8、為了加快 BCA 法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過熱，否則易失效。
有效期： 12 個月有效。蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制成溶液后應(yīng)-20℃凍存。附錄 1：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在室溫條件下按說明書操作，對系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行吸光度的
測定，其數(shù)值及標(biāo)準(zhǔn)曲線如下(僅供參考)，我們建議采用 50、100、200、300、400、500
μg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)品濃度過高或過低都有可能影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性)：
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(μg/ml)
25
50
100
200
300
400
500
吸光度
0.010 0.035 0.094 0.141 0.237 0.319 0.405
注意：對于 10-50μg/ml 范圍內(nèi)的蛋白樣品，要充分考慮如 EDTA、2-ME、DTT 等干
擾因素，其檢測結(jié)果波動較大，標(biāo)準(zhǔn)品亦有波動，請注意小心精細(xì)操作
附錄 2：
與國內(nèi)產(chǎn)品進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，在室溫相同條件下按說明書操作，
對系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行吸光度的測定，采用 50、100、200、300、400、500μg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示 試劑盒斜率優(yōu)于某 BCA 試劑盒
及標(biāo)準(zhǔn)曲線如下(僅供參考)：
BCA