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主要用途

活體組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）初級熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在組織氧化損傷條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測組織內(nèi)活性氧族的生成和增加的較好而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。適宜于活體動物組織的分析?？梢员挥糜诩毎蛲?、信號傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細胞衰老或凋亡。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種*自由通過細胞膜的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生綠色熒光。據(jù)此測定組織細胞內(nèi)活性氧族的濃度。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

 

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證12月

 

用戶自備

50毫升錐形離心管：用于組織收集的容器

15毫升錐形離心管：用于工作液配制和組織處理的容器

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

6孔細胞培養(yǎng)板：用于組織染色的容器

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織

熒光分光光度儀：用于組織熒光定量檢測

 

實驗步驟

 

方法一：新鮮組織薄片定性檢測

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出25微升染色液（Reagent B）到新的15毫升錐形離心管，加入2.5毫升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室里。然后進行下列操作。

1． 手術(shù)取出動物組織

2． 放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． 加入3毫升清理液（Reagent A）浸泡15秒

4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干

5． 即刻用刀片切離組織為1cm X 1cm大小的片狀組織

6． 用鑷子將組織薄片放進6孔培養(yǎng)板的一個孔

7． 加入2.5毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液

8． 放進37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘，避免光照（注意：如果組織薄片較厚，可以增加孵育時間至60分鐘）

9． 小心抽去染色工作液

10．加入3毫升清理液（Reagent A）

11．用鑷子將組織薄片放在載玻片上

12．壓片

13．即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm――綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高

 

方法二：組織勻漿定量檢測

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出25微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室里。然后進行下列操作。

1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量

2． 移取1克組織，放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． 加入3毫升的清理液（Reagent A）

4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干

5． 即刻用刀片切碎組織

6． 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管

7． 加入5毫升預(yù)冷的稀釋液（Reagent C）

8． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

9． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

10．在冰槽里用研磨棒勻化組織（注意：切莫過度勻化）

11．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

12．置入冰槽里備用

13．移取5微升組織勻漿物進行蛋白定量檢測

14．移取50微升組織勻漿物（樣品）或50微升稀釋液（Reagent C）（背景對照）到1毫升石英比色杯里

15．加入950微升升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液

16．上下傾倒混勻

17．放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照

18．即刻放進熒光分光光度儀檢測：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm——（樣品RFU-對 

方法三：組織勻漿微量檢測

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入200微升稀釋液（Reagent C)，混勻后，將染色工作液置入暗室里。然后進行下列操作。

1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量

2． 移取200毫克組織，放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． 加入1毫升的清理液（Reagent A）

4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干

5． 即刻用刀片切碎組織

6． 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管

7． 加入1毫升預(yù)冷的稀釋液（Reagent C）

8． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

9． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

10．在冰槽里用研磨棒勻化組織（注意：切莫過度勻化）

11．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

12．置入冰槽里備用

13．移取5微升組織勻漿物進行蛋白定量檢測

14．移取50微升組織勻漿物（樣品）或50微升稀釋液（Reagent C）（背景對照）到1毫升石英比色杯里

15．加入200微升升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液

16．上下傾倒混勻

17．放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照

18．即刻放進熒光酶標(biāo)儀檢測：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm——（樣品RFU-對照RFU）＝實際RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

 

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（1克組織）、100次（200毫克組織）、500次（200毫克組織，酶標(biāo)板）或40次（組織薄片）操作

2． 建議使用新鮮組織，手術(shù)切除后1小時內(nèi)的樣品

3． 操作時，須戴手套

4． 孵育時，須避免光照

5． 如果組織薄片較厚，可以增加孵育時間至60分鐘

6． 組織勻漿時，切莫過度

7． 建議組織染色完成后，即刻進行熒光定量或定性分析

8． 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液，觀察組織熒光增強現(xiàn)象

9． 本公司提供系列活性氧檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰