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AO染色液吖啶橙說明書
閱讀：1849 發(fā)布時(shí)間：2022-7-14Acridine Orange屬于三環(huán)雜芳香燃料，可以標(biāo)記DNA、RNA，屬于異染性熒光染料。該染料具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色。因此AO常用于細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA進(jìn)行檢測(cè)。AO與核酸結(jié)合方式主要有：1、插入性結(jié)合，AO嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，這種結(jié)合方式主要為AO與DNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為530nm，激發(fā)后呈綠色熒光；2、靜電吸引，帶正電荷的AO與單鏈核酸的磷酸根(帶負(fù)電荷)產(chǎn)生靜電間的吸引結(jié)合，這種結(jié)合方式主要為AO與RNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為640nm，激發(fā)后呈紅色熒光，少量結(jié)合會(huì)呈桔黃色或桔紅色熒光。因此，吖啶橙嵌合到雙鏈DNA中顯綠色，與單鏈DNA或RNA結(jié)合時(shí)發(fā)桔黃色或橙紅色熒光。
AO染色液(1mg/ml)為儲(chǔ)存液，使用時(shí)應(yīng)稀釋到合適濃度后使用。染色后在熒光顯微鏡下觀察，AO可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；而在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。AO使其染上致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒；而壞死細(xì)胞黃熒光減弱甚至消失。AO染色常與EB染色合用雙染，因EB只染死細(xì)胞使之產(chǎn)生桔黃色熒光，由此可區(qū)分出正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。
自備材料：
熒光顯微鏡
低速離心機(jī)
PBS
細(xì)胞計(jì)數(shù)板
載玻片、蓋玻片
操作步驟(僅供參考)：
收集細(xì)胞(采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，應(yīng)先固定細(xì)胞)，用PBS清洗細(xì)胞1次，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106/ml。
取適量的細(xì)胞懸液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO終濃度為8.5～17μg/ml，輕輕混勻。
室溫避光染色15～20min，滴加于載玻片上并加蓋玻片或上流式細(xì)胞儀分析。
熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長(zhǎng)488nm)，計(jì)數(shù)并拍照。
染色結(jié)果：
正常細(xì)胞 單鏈DNA或RNA | 細(xì)胞被均勻染成黃綠色熒光 (發(fā)射波長(zhǎng)510~540nm) |
凋亡細(xì)胞 雙鏈DNA | 染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀，被染成大小不一、致密濃染的綠色顆粒(發(fā)射波長(zhǎng)大于600nm) |
注意事項(xiàng)：
Acridine Orange Stain(1mg/ml)不含破膜劑，較少單獨(dú)使用。
吖啶橙染色常與EB染色合用，可區(qū)分出正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。
如有低溫離心機(jī)進(jìn)行離心效果更佳。
操作過程中應(yīng)注意減少試劑暴露于強(qiáng)光下的時(shí)間。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期： 12個(gè)月有效。常溫運(yùn)輸，4℃保存。