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乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑說明書
閱讀：1818 發(fā)布時間：2022-8-25主要用途 乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑是一種旨在通過酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)檢測由于細胞損 傷導(dǎo)致的細胞內(nèi)穩(wěn)定的乳酸脫氫酶釋放到細胞外，使四唑鹽染料碘硝基氯化四氮唑（INT）還原為紅色甲臜 （farmazan），即比色法定量測定酶活性，以評價活體細胞繁殖的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心 研制、成功實驗證明的。適用于各種藥物、化學(xué)、環(huán)境因子和營養(yǎng)因子處理的貼壁或懸浮生長中的動物或人 體細胞。替代傳統(tǒng)的同位素[51 Cr]釋放檢測的。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，簡捷敏感，性能穩(wěn)定， 顯色清晰，檢測準(zhǔn)確，重復(fù)性好。
技術(shù)背景 細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結(jié)構(gòu)的損害或*裂解導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的酶釋放外泄到培養(yǎng)液里，其中包括活 性穩(wěn)定的乳酸脫氫酶。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）釋放法的測定是基于在乳酸脫氫酶的作用 下，還原NAD+反應(yīng)生成的NADH，再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium； INT）在硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）的催化下反應(yīng)生成紅色生色產(chǎn)物甲臜（formazan），在490nm波長下產(chǎn) 生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細胞膜完整性的標(biāo)志：吸光值與細胞死亡或毒性程度成 線性正相關(guān)。酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容 裂解液（Reagent A） 毫升 補充液（Reagent B） 毫升 反應(yīng)液（Reagent C） 毫升 顯色液（Reagent D） 毫升 終止液（Reagent E） 毫升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F） 微升（另購） 產(chǎn)品說明書 1 份
保存在－20℃冰箱里，反應(yīng)液（Reagent C）和顯色液（Reagent D）避免光照；有效保證 6 月
96 孔細胞培養(yǎng)板：用于細胞操作的容器 細胞培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng) 孔板離心機：用于沉淀細胞 酶標(biāo)儀：用于定量檢測染色后的細胞
1． 準(zhǔn)備 96 孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞（每孔 100 微升）：包括未處理的對照細胞（樣品對照孔），未處理的 后續(xù)裂解的細胞（樣品最大酶活性對照孔），以及藥物處理的細胞（處理樣品孔），并做好標(biāo)記（細胞密 度為每孔 2 X 103 至 2 X 104細胞）
2． 到規(guī)定的檢測時間點前 1 小時，從濕潤的細胞培養(yǎng)箱里取出待測的 96 孔細胞培養(yǎng)板（注意：確保細胞培 養(yǎng)液維持在 100 微升容量） 3． 加入 xx 微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續(xù)裂解的細胞孔里（樣品最大酶活性對照孔）
4． 同時加入 xx 微升補充液（Reagent B）到其余所有檢測孔里
5． 放回濕潤的細胞培養(yǎng)箱里，繼續(xù)培養(yǎng) 1 小時，即規(guī)定檢測時間
6． 從濕潤的細胞培養(yǎng)箱里取出待測的 96 孔細胞培養(yǎng)板
7． 放進孔板離心機離心 10 分鐘，速度為 250g
8． 分別小心移取 50 微升上清液到新的 96 孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細胞顆粒，同時注意做好標(biāo)記
9． 分別加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）
10．分別加入 xx 微升顯色液（Reagent D）
11．搖動 96 孔板混勻
12．在室溫下孵育 30 分鐘，避免光照
13．（選擇步驟）分別加入 xx 微升終止液（Reagent E）
14．即刻放進酶標(biāo)儀里測讀：波長 490nm
15．計算處理樣品實際吸光讀數(shù)：處理樣品孔吸光讀數(shù)－樣品對照孔吸光讀數(shù)
16．計算樣品細胞最大酶活性的實際吸光讀數(shù)：樣品最大酶活性對照孔吸光讀數(shù)－樣品對照孔吸光讀數(shù)
17．計算細胞毒性或死亡率（％）： （處理樣品實際吸光讀數(shù)÷樣品細胞最大酶活性的實際吸光讀數(shù)）X 100 18．或繪制細胞生長曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為實際吸光讀數(shù)（A）；橫坐標(biāo)（X 軸）為細胞數(shù)或時間點或藥物 濃度；據(jù)此計算其 LD50