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19239.4 v.A

 

體液糖胺多糖（GAG）總含量二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）比色法定量檢測

試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

體液糖胺多糖（GAG）總含量二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）比色法定量檢測試劑是一種旨在通過高鹽萃取可溶性糖胺多糖，與二甲基亞甲基藍(lán)染料結(jié)合，在丙醇解離溶液中，釋放紫紅色染料，由分光光度儀比色分析，定量檢測組織樣品中糖胺多糖含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種人體或動(dòng)物體液（例如腦脊液、關(guān)節(jié)滑液、尿液等），以及細(xì)胞培養(yǎng)液的糖胺多糖水平檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測準(zhǔn)確。

 

技術(shù)背景

 

糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖（mucopolysaccharide），是體內(nèi)最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負(fù)電荷性長鏈多聚糖，由重復(fù)的二糖單位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），鏈接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖與核心蛋白（core protein）共價(jià)相聯(lián)，構(gòu)成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成為細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發(fā)生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于發(fā)揮各種不同的作用，包括酶的調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、生長、遷移、分化，以及組織損傷反應(yīng)。基于糖胺多糖的高度負(fù)電荷的特點(diǎn)，使用異染性（metachromatic）陽離子藍(lán)色染料二甲基亞甲基藍(lán)（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性條件下，特異性的結(jié)合產(chǎn)生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復(fù)合物（Dye-GAG complex），在丙醇解離溶液中，釋放出染料，通過分光光度儀（656nm波長）測定，來定量分析糖胺多糖的總含量。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）                1毫升

萃取液（Reagent B）                1毫升

染色液（Reagent C）            25毫升

解離液（Reagent D）            25毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）           100微升

產(chǎn)品說明書            1份

 

保存方式

 

保存萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或干式恒溫儀：用于樣品反應(yīng)

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、樣品預(yù)處理  

 

1． 準(zhǔn)備好1.5毫升離心管

2． 移取1毫升液體（尿液/腦脊液/唾液/精液/關(guān)節(jié)液/培養(yǎng)液樣品）到離心管

3． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管

5． 加入50微升萃取液（Reagent B） 

6． 強(qiáng)力渦旋震蕩1分鐘，充分混勻

7． 放進(jìn)56℃恒溫水槽孵育16小時(shí)

8． 放進(jìn)90℃恒溫水槽孵育10分鐘

9． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管

11． 置于冰槽里備用

 

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

 

1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

2． 分別加入50微升清理液（Reagent A）到1至5號(hào)管

3． 移取50微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻

4． 小心移取50微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻

5． 小心移取50微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻

6． 小心移取50微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻

7． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

 

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

 

1． 移取50微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1.5毫升離心管

2． 加入1毫升染色液（Reagent C）

3． 渦旋震蕩15秒

4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒

5． 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g

6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）

7． 加入1毫升解離液（Reagent D）

8． 渦旋震蕩15秒

9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）

10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿

11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)

12． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至11四次

13． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)糖胺多糖含量（微克）

 

四、 樣品測定

 

1． 加入50微升上述制備的待測樣品到1.5毫升離心管

2． 加入1毫升染色液（Reagent C）

3． 渦旋震蕩15秒

4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒

5． 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g

6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）

7． 加入1毫升解離液（Reagent D）

8． 渦旋震蕩15秒

9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）

10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿

11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得樣品吸光讀數(shù)

12． 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)糖胺多糖含量（微克）

 

五、 濃度計(jì)算

 

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品對(duì)應(yīng)糖胺多糖含量（微克）÷0.050（樣品容量；毫升）＝微克糖胺多糖/毫升 

 

注意事項(xiàng)

 

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品

2． 本產(chǎn)品不適合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明質(zhì)酸（hyaluronate）的檢測

3． 本產(chǎn)品可以檢測硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate）、硫酸類肝素（heparan sulfate）等主要糖胺多糖

4． 本產(chǎn)品檢測范圍為0.2至5微克糖胺多糖

5． 操作時(shí)，須戴手套

6． 系統(tǒng)操作時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣品測定只需1次

7． 空白對(duì)照讀數(shù)通常小于0.06，如果超過表明抽去上清操作不當(dāng)

8． 孵育時(shí)，避免光照

9． 如果樣品糖胺多糖含量過低，可以濃縮樣品或增加樣品量至100微升

10． 樣品濃度可以表述為：微克糖胺多糖/總蛋白等

11． 本公司提供系列糖類代謝檢測試劑產(chǎn)品

 

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感