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10131.2 v.A

 

組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量檢測試劑是一種旨在通過有機(jī)氮自由基染料DPPH的參與，在抗氧化劑的存在下，通過分光光度儀，觀察其峰值下降的變化，來定量檢測對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種新鮮組織（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）的總抗氧化能力檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypocorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達(dá)到消除或降低ROS的損害。通過穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化劑的去自由基作用，呈現(xiàn)深紫色轉(zhuǎn)化為黃色的變化，衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基、消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（515nm波長）的幫助下，觀察其峰值下降的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）                     250毫升

低滲液（Reagent B）                      25毫升

緩沖液（Reagent C）                      20毫升

染色液A（Reagent D1）                      1瓶

染色液B（Reagent D2）                     10毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）                     200微升

產(chǎn)品說明書                 1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于組織樣品操作的容器

2毫升離心管：用于組織樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于組織裂解懸液存放的容器

4℃微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

超聲儀：用于破碎組織細(xì)胞

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、 樣品準(zhǔn)備

 

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量200毫克

2． 移入到一個(gè)液氮凍存管

3． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

4． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

5． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

6． 加入2毫升4℃預(yù)冷的 清理液（Reagent A）

7． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

8． 轉(zhuǎn)移到4℃預(yù)冷的2毫升離心管

9． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心抽去上清液

11． 加入1毫升4℃預(yù)冷的 清理液（Reagent A），混勻

12． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心抽去上清液

14． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11至13二次

15． 加入500微升低滲液（Reagent B），混勻

16． 置于200瓦超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里

17． 超聲功率為100％，猝擊10秒，2個(gè)循環(huán)

18． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）

19． 移取上清液到新的4℃預(yù)冷的1.5毫升離心管

20． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

21． 使用清理液（Reagent A）調(diào)整蛋白濃度為100微克/10微升

22． 置于冰槽里待測

 

二、標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)備

 

1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管

2． 分別加入50微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管

3． 移取100微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻

4． 小心移取50微升1號管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻

5． 小心移取50微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻

6． 小心移取50微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻

7． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

 

三、 樣品測讀

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取5毫升染色液B（Reagent D2）到1瓶染色液A（Reagent D1）里，混勻，置于暗室里，標(biāo)記為染色工作液，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

1． 準(zhǔn)備1個(gè)96孔板，做好標(biāo)記：空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品孔、待測樣品孔

2． 分別移取205微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里的每個(gè)孔里

3． 分別加入25微升染色工作液 

4． 加入20微升緩沖液（Reagent C）到空白對照孔

5． 加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里

6． 加入20微升樣品（100微克蛋白總量）到待測樣品孔里

7． 輕輕搖動(dòng)96孔板，使其混勻

8． 室溫下孵育15分鐘

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測讀：515nm波長

10． 分析結(jié)果：

1） 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD515nm）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)Trolox濃度（微摩爾/升）

2） 空白對照孔為最大吸光單位（OD515nm）讀數(shù)

3） 標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和待測樣品孔為實(shí)際吸光單位（OD515nm）讀數(shù)

4） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）

5） 計(jì)算樣品實(shí)際總抗氧化能力

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）×0.25（體系容量：毫升）×樣品稀釋倍數(shù)】÷0.02（樣品容量：毫升）=（微摩爾/升TROLOX等值）

6） 根據(jù)下列公式計(jì)算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實(shí)際抑制百分率）

【（空白對照孔吸光單位讀數(shù)－實(shí)際吸光單位讀書）÷空白對照孔吸光單位讀數(shù)】×100％

7） IC50:50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品蛋白量（毫克/毫升）或樣品容量（微升）

X（所需樣品單位）=（已知樣品單位÷實(shí)際抑制百分率）×50％

 

 

注意事項(xiàng)

 

1． 本產(chǎn)品為50次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)品

2． 本產(chǎn)品測試范圍為10至100微摩爾Trolox等值

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態(tài)下進(jìn)行

5． 用戶可以調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)間

6． 測試前，樣品須新鮮收集

7． 樣品須清澈

8． 空白對照孔的吸光讀數(shù)應(yīng)為1.0左右為佳

9． 樣品讀數(shù)越低，抗氧化能力越高

10． 可以使用比色皿檢測

11． 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低， 建議稀釋或增加樣品容量或濃度

12． 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）

13． 如果測試樣品很多，建議使用排槍移液

14． 本公司提供系列抗氧化分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感