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主要用途

細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶 3（MMP-3）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)含硫多肽底物以及特定抑制劑

存在與否的情況下，受到 MMP3 的水解，釋放出巰基，進(jìn)而使用 Ellman 試劑，產(chǎn)生黃色 5-巰基-2-硝基苯

甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)

經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或純化酶樣

品中基質(zhì)金屬蛋白酶 3 的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操

作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。 技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的

總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細(xì)胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少

有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)

形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞

浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，

主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，

主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；

（4）膜型金屬蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)

絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲(chǔ)備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號(hào)傳遞到細(xì)胞后才臨時(shí)合成，合成的MMPs以無(wú)活性的酶

原（proenzyme）形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs 可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)?；|(zhì)金屬蛋白酶-3（EC3.4.24.17），又稱基質(zhì)裂解素1（stromelysin-1）、

轉(zhuǎn)換素1（transin-1）或蛋白多糖酶（proteoglycanase），是糖基化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶，其前體分子量為55至

59kDa，激活后分子量為21至48kDa。它在血清或細(xì)胞上清中濃度通常為10至200納克/毫升。它的作用目標(biāo)

是膠原蛋白III、IV、V、IX（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連

蛋白 （laminin）、纖溶酶原（plasminogen）、HB-EGF、E-鈣粘附蛋白（E-cadherin）、其它MMP（2、7、

8、9、13）、TIMP2、IL-1β、MBP、明膠、蛋白聚糖（aggrecan）、串珠素（perlecan）、核心蛋白聚糖（decorin）、

骨粘連蛋白（osteonectin）、卵白抑制素（ovostatin）、entactin等?；|(zhì)金屬蛋白酶-3降解各種細(xì)胞外基質(zhì)

成分，并作為絲氨酸類（serpin type）蛋白酶抑制劑。與腫瘤促發(fā)、結(jié)締組織重塑（remodeling）、傷口修復(fù)、

動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展等疾病有關(guān)?；诤蚨嚯模╰hiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）

-LG-OC2H5，在特異性抑制劑UK356618存在與否的條件下，受到MMP3的水解，釋放出巰基（sulfhydryl

group），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反

應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶3的特異活性。基質(zhì)金屬蛋白酶3反應(yīng)系統(tǒng)為： 產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

2

緩沖液（Reagent C） 毫升

反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

底物液（Reagent E） 微升

陰性液（Reagent F） 微升

專性液（Reagent G） 微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1 份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）、專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；緩沖液（Reagent

C）保存在室溫下；其余的保存在 4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和專性液（Reagent

G）避免光照；有效保證 3 月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

200 微升 1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好 75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 100mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 10

7細(xì)胞）

2． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11．強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

15．移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 BCA 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）

16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

3

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長(zhǎng) 412nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 15 次（共 15 分鐘），并置

零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 （選擇步驟）樣品背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升陰性液（Reagent F）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測(cè)樣品（100 微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（15 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

四、 樣品總活性測(cè)定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測(cè)樣品（100 微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

五、樣品非特異活性測(cè)定

檢測(cè)開(kāi)始前，移取 10 微升待測(cè)樣品（100 微克總蛋白）到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升專性液（Reagent

G），混勻后，在 37℃溫度下孵育 30 分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 20 微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

六、計(jì)算樣品活性

4

（一） 樣品活性（總活性或非特異活性）

（二） 樣品特異活性

七、 酶標(biāo)儀測(cè)定

（一） 樣品總活性檢測(cè)

1． 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景（選擇步驟）和樣品活性

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中的所有孔里

3． 分別加入 x 微升反應(yīng)液（Reagent D）到所有孔里

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）到樣品活性孔里

5． 加入 xx 微升陰性液（Reagent F）到樣品背景孔里

6． 輕輕搖動(dòng) 96 孔板

7． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 5 微升待測(cè)樣品（50 微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng) 96 孔板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0 分鐘讀數(shù)和 15 分鐘讀數(shù)

11．活性計(jì)算：

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（二） 樣品非特異性活性檢測(cè)

檢測(cè)開(kāi)始前，移取 5 微升待測(cè)樣品（50 微克總蛋白）到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升專性液（Reagent

G），混勻后，在 37℃溫度下孵育 30 分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品

2． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 96 孔板里

3． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動(dòng) 96 孔板

6． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

7． 加入 10 微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

8． 輕輕搖動(dòng) 96 孔板

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0 分鐘讀數(shù)和 15 分鐘讀數(shù)

10．活性計(jì)算：

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（三） 樣品特異性活性計(jì)算

5

樣品總活性－樣品非特異活性 ＝樣品特異活性

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 20 次（10 個(gè)樣本；比色皿）和 50 次（25 個(gè)樣本；96 孔板）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次

4． 專性液（Reagent G）嚴(yán)禁反復(fù)凍融；有效期為 3 個(gè)月

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品準(zhǔn)備要點(diǎn)如下：

a) 樣品中避免使用 EDTA、EGTA 等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）

－12197）

7． 建議使用比色皿測(cè)定

8． 如果試劑室溫下不能融化，可以置于手心焐熱融化即可

9． 樣品須澄清，至關(guān)重要

10．加樣后 3 秒內(nèi)比色測(cè)定

11．測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù) 15 分鐘

12．比色測(cè)定后，比色皿須清洗

13．樣本測(cè)定 15 分鐘讀數(shù)高于 0 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

14．待測(cè)樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為 20 微克/10 微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為 100

微克/10 微升（本公司提供 BCA 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 30031.1）

15．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

16．如果檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶 3 抑制劑，在加入底物液（Reagent E）前，37℃下孵育 30 分鐘

17．如果檢測(cè)部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶 3，則可以省去非特異活性檢測(cè)步驟

18．基質(zhì)金屬蛋白酶 3 酶活性單位濃度定義：在 37℃溫度下，pH 6.0 的情況下，每單位 UK356618 敏感性

酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解 1 微摩爾的含硫多肽底物

19．本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感