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動物細(xì)胞高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

 

動物細(xì)胞高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑是一種旨在通過機(jī)械或化學(xué)處理、差速和等密度離心方法，從動物細(xì)胞中分離出活性完整而高度純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達(dá)99％。適合于各種動物原代和培養(yǎng)細(xì)胞（人體、老鼠、兔子等）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的制備?？梢员挥糜诩?xì)胞色素P450系統(tǒng)外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白和腔內(nèi)蛋白等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。

 

技術(shù)背景

 

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細(xì)胞器組分，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)蛋白轉(zhuǎn)譯、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)成為細(xì)胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負(fù)責(zé)鈣離子區(qū)隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產(chǎn)和儲存等功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分成三種：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據(jù)細(xì)胞代謝的需要，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會互相轉(zhuǎn)換。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過核糖體合成蛋白質(zhì)并分類；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質(zhì)網(wǎng)的主要功能為儲存和釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）        100毫升

裂解液（Reagent B）        100毫升

凈化液（Reagent C）        10毫升

活性液（Reagent D）        100微升

強(qiáng)化液（Reagent E）        5毫升

保存液（Reagent F）        50毫升

高純液（Reagent G）        25毫升

分層液（Reagent H）        25毫升

產(chǎn)品說明書           1份

 

保存方式

 

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

50毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺式離心機(jī)：用于樣品制備

4℃超速離心機(jī)：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

試管固定支架：用于離心管固定支撐

3號針筒和18號針頭：用于收集樣品

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、 組織勻漿法

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、 1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去

3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次

4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面

5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種

6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，

7． 分別加入10毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入一個50毫升錐形離心管

9． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

12． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液

15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

16． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

17． 在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）

18． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

19． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g

20． 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解細(xì)胞

21． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心15分鐘，速度為12000g

22． 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF）

23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g

24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分

25． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物

26． 置于冰槽里備用

27． 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管

28． 加入2.5毫升高純液（Reagent G）

29． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）

30． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（注意：避免晃動）

31． 小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心30分鐘，速度為130000g

32． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和下端三分之一處（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）棕色或乳黃色樣品帶

33． 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

34． 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

35． 進(jìn)一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

36． 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

37． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F）

38． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為100000g

39． 小心抽去上清液

40． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻

41． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

二、 化學(xué)處理法

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去

3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次

4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面

5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種

6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

7． 分別加入10毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入一個50毫升錐形離心管

9． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）

12． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液

15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

17． 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）

18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）

20． 加入5毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B），輕輕搖動試管混勻

21． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g

22． 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解細(xì)胞

23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為12000g

24． 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF）

25． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g

26． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分

27． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物

28． 置于冰槽里備用

29． 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管

30． 加入2.5毫升高純液（Reagent G）

31． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）

32． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（注意：避免晃動）

33． 小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心30分鐘，速度為130000g

34． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和下端三分之一處（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）棕色或乳黃色樣品帶

35． 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

36． 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

37． 進(jìn)一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

38． 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

39． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F）

40． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為100000g

41． 小心抽去上清液

42． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻

43． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

 

注意事項

 

1． 本產(chǎn)品為10次（5 X 10⁷動物細(xì)胞）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent F）

4． 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行

5． 建議使用足夠的樣品量

6． 建議嚴(yán)格控制操作時間

7． 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

8． 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)

9． 對于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

10． 腦組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉淀顆粒非常松動，注意操作損失

11． 通常5 X 10⁷動物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量為500至1000微克蛋白

12． 本產(chǎn)品所獲得的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純度達(dá)95%以上

13． 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志蛋白是NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用 組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶活性比色法定量檢測試劑盒－50303.2

14． 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志是核糖體RNA（ribosome RNA）；建議使用 RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑盒——20129

15． 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持正常活性

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶