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脂氧合酶活性測定試劑盒使用說明
閱讀：723 發(fā)布時間：2024-8-19注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
規(guī)格：50 管/48 樣
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 試劑二，充分溶解。
產(chǎn)品說明：
LOX 廣泛存在于植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)，導致膜脂過氧化。在植物的生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。
LOX 催化亞油酸氧化，氧化產(chǎn)物在 234nm 處有特征吸收峰；測定 234nm 吸光度增加速率，來計算 LOX 活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
操作步驟：
一、粗酶液提取：
按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測。
二、測定：
1.分光光度計預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 234 nm，蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二在 25℃水浴中預熱 30 min。
3.空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 蒸餾水、800μL 試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 234nm 比色，記錄 15s 和 75s 的吸光值，分別記為 A1 和 A2。
4.測定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 234nm 比色，記錄 15s 和 75s 的吸光值，分別記為 A3 和 A4。
注意：空白管只需測定一次。三、LOX 活性計算公式：
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.001 個單位為 1 個酶活單位。
LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T×1000
= 10000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.001 個單位為 1 個酶活單位。
LOX (U/g) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000
= 10000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W
Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒； V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣總：上清液總體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1min。
注意事項：
1.試劑三易自發(fā)氧化，從而導致空白管測定值偏高，必須臨用前配制，并且當天使用完畢。
2.樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日完成酶活性測定。