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真菌/酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

真菌/酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧初級(jí)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用真菌/酵母菌株細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧的分析?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

真菌/酵母細(xì)胞是一種低等單細(xì)胞真核生物，具有細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡(jiǎn)單明了等原核生物的特點(diǎn)。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，在分子遺傳學(xué)方面認(rèn)識(shí)早，先作為外源基因表達(dá)的細(xì)胞宿主。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種*自由通過細(xì)胞膜的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。據(jù)此測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    200毫升

染色液（Reagent B）    500微升

稀釋液（Reagent C）     50毫升

溶解液（Reagent D）     25毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母染色的容器

載玻片：用于染色觀察

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀真菌/酵母細(xì)胞

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

比色皿：用于熒光定量分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入冰槽里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
• 加入1毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，混勻（注意：參見注意事項(xiàng)7）
• 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長(zhǎng)488nm氬離子激光，觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取5微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升溶解液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）室溫下，靜置15分鐘，避免光照

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本產(chǎn)品染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據(jù)不同菌株類型，可以調(diào)整染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供陽性對(duì)照甲萘醌溶液（12041），觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
• 本公司同時(shí)提供真菌/酵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒（10016.7），滿足不同用戶需求
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰