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當(dāng)前位置：> 供求商機(jī)> 10907ES20-Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit
貨物所在地：上海上海市
更新時(shí)間：2025/1/19 21:00:07
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產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存 | 價(jià)格（元） |
Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20T | -20℃ | 528.00 |
Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES60 | 5×20T | -20℃ | 2378.00 |
產(chǎn)品描述
本試劑盒是利用拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA （脫氧和糖核酸）片段的原理進(jìn)一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：1）快速，僅需1-5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2）高效，無自連現(xiàn)象，陽(yáng)性克隆率接近*，無需設(shè)置藍(lán)白斑篩選；3）操作簡(jiǎn)單，從連接到涂板僅需15-20min。操作過程省去冰浴、熱激和1h復(fù)蘇等。4）可連接長(zhǎng)達(dá)10kb目的產(chǎn)物。
產(chǎn)品用途
A尾PCR產(chǎn)物的快速克隆。
克隆后PCR產(chǎn)物的快速測(cè)序【使用M13F/M13R引物】。
產(chǎn)品組分
組分編號(hào) | 組分名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào)（規(guī)格） | |
10907ES20（20T） | 10907ES60（5×20T） | ||
10907-A | pESI-T vector (30ng/µl) | 20µl | 5×20µl |
10907-B | 1kb control insert(40ng/µl) | 5µl | 5×5µl |
10907-C | 10×Enhancer | 20µl | 5×20µl |
運(yùn)輸和保存方法
冰袋運(yùn)輸。-20°C保存，避免反復(fù)凍融。有效期一年。
注意事項(xiàng)
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用方法
♣ Control DNA （脫氧核糖核酸）片段的克隆實(shí)驗(yàn)
1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10µl為例。
10 ´ Enhancer | 1µl |
1kb control insert (40ng/µl) | 1µl |
pESI-T vector (30ng/µl) | 1µl |
ddH2O | 7µl |
2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5min。
【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間不要超過5min，一般1-2min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。
3）連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化或于-20℃保存。
4）全量10ml加入100ml感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，室溫放置5min。
【注1】：也可取5ml連接液，加入50ml感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)。
【注2】：通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時(shí)，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
5）加300-500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃180 rpm振蕩培養(yǎng)10min。
6） 取200ml菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)一個(gè)晚上（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1min，吸棄掉部分上清，保留100ml，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。
♣ 一般DNA（脫氧核糖核酸）片段的克隆實(shí)驗(yàn)
所插入片段為含A尾產(chǎn)物，利用常規(guī)Taq酶（Yeasen，Cat#10101-10107），或熱啟動(dòng)型Taq酶（Yeasen，Cat#10110）， 或長(zhǎng)片段DNA聚合酶（Yeasen，Cat#10107ES62）擴(kuò)增得到的產(chǎn)物如無非特異性條帶、引物二聚體可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。
否則建議膠回收后使用。
【注】：a、PCR產(chǎn)物不能磷酸化。
b、如擴(kuò)增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中引起假陽(yáng)性，因此推薦PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接。
1）按照下表配制連接體系（以10µl為例*）
10 ´ Enhancer | 1µl |
pESI-T vector(30ng/µl) | 1µl |
插入片段** | 0.5-8µl |
ddH2O | To 10µl |
【注】：* 可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況按照上述比例調(diào)整反應(yīng)體系。
** 不同的插入片段所用量參考下表
插入片段大小（1kb） | *用量(ng) |
0.1-1kb | 20-50 ng |
1-2kb | 50-100 ng |
2-5kb | 100-200 ng |
2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5min。
【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間不要超過5min，一般1-2min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。
3）全量10ml加入100ml感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，室溫放置5min。
【注1】：也可取5ml連接液，加入50ml感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)。
【注2】：通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時(shí)，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
4）加300-500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃180 rpm振蕩培養(yǎng)10min。
【注】：通常商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過2kb插入片段情況下，10min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)效率低或者插入片段長(zhǎng)轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到30-60min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。
5） 取200ml菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)一個(gè)晚上（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1min，吸棄掉部分上清，保留100ml，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。
6）轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定
① 菌液PCR鑒定；
② 質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進(jìn)行鑒定。
③ 酶切鑒定：根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。
④ 測(cè)序分析：可選測(cè)序引物序列如下
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC
【注】：本制品陽(yáng)性率相當(dāng)高，一般情況下，陽(yáng)性克隆率接近*，只要是長(zhǎng)出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就是陽(yáng)性克隆，因此插入片段不超過2-3kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個(gè)菌去測(cè)序。
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