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1.聚合酶鏈反應(yīng)(英文全稱:Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。Real -Time PCR,即實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法,它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì),并通過Real -Time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,zui終對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理的方法。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來,廣泛應(yīng)用于生物研究的各個(gè)領(lǐng)域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探針法兩種。

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2 方法

2.1 組織總RNA的提取

1)取組織或者細(xì)胞于1mLTrizol的勻漿管中,于勻漿機(jī)勻漿20sec,立即放于冰上;

2)置于超凈臺中,溫育5min,12000r/min,離心10min;

3)吸上清于新的1.5mL離心管中,加入200μL的氯仿,搖勻,室溫靜置2min4℃,12000r/min,離心10min;

4)吸取上清于新的1.5mL離心管中,加入600μL的異丙醇,混合均勻,室溫靜置15min4℃,12000r/min,離心15min,棄上清;

5)加入1mL75%的無水乙醇(750μL無水乙醇+250μL DEPC水)漂洗沉淀,4℃,12000r/min,離心5min,棄上清;

6)加入1mL無水乙醇,漂洗沉淀,4℃,12000r/min,離心5min,棄上清,室溫干燥10min;

7)加入40μLDEPC水溶解RNA,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2 cDNA*條鏈的合成

2.2.1  RNADNA的消除

DNaseⅠ:

 

1μL

10×DNase Buffer

 

1μL

RNA

 

1ng

DEPC-H2O

 

   nμL

總體積:

 

10μL

37℃,30min;Hold,加1μLEDTA;65℃,10min。

2.2.2 反轉(zhuǎn)錄

(1)按以下體系加入:

RNA-Primer Mix

12μL

5×RT Reaction Buffer

5μL

25mM dNTPs

1μL

25U/μL RNase Inhibitor  

1μL

200U/μL M-MLV Rtase

1μL

Oligodt18

1μL

ddH2O(DNase-free)

4μL

總體積:

25μL

反應(yīng)程序:37℃,60min;85℃,5min;4℃,5min;置于-20℃保存。

2.3 Real-time PCR擴(kuò)增

將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系如下:

SYBRGreen Mix       12.5μL

上游引物F            0.5μL

下游引物R            0.5μL

ddH2O 9.5μL

cDNA模板 2μL

總體積 25μL

反應(yīng)程序:

95℃ ,10min(95℃,15Sec;60℃,45Sec)×40;95℃,15 Sec; 60℃,1min;95℃,15 Sec;60℃, 15 Sec;

數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析:ABI Prism 7300 SDS Software

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提供實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

cytochrome c mRNA擴(kuò)增動力學(xué)曲線

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