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【CEM Liberty】全自動(dòng)微波增強(qiáng)蛋白質(zhì)全合成
閱讀：1034發(fā)布時(shí)間：2024-2-22
摘 要
使用微波增強(qiáng)的固相多肽合成（SPPS）技術(shù)和Liberty Blue™ 2.0以及Liberty PRIME™ 2.0可以快速高效地合成蛋白質(zhì)和長(zhǎng)肽。優(yōu)化后的微波SPPS結(jié)合了一種新的頂部沖洗技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)更高純度的蛋白質(zhì)序列合成。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)通過一系列生物相關(guān)蛋白質(zhì)（如泛素、巴氏蛋白、胰島素原、膠原、HIV蛋白酶和MDM2）的合成得到驗(yàn)證，這些蛋白質(zhì)含有76-127個(gè)氨基酸，通過逐步組裝獲得良好純度，無需任何連接步驟。通過在Prodigy™制備型HPLC肽純化系統(tǒng)上以60°C的高溫色譜法從粗制品中分離出高純度樣品。
引 言
蛋白質(zhì)和長(zhǎng)肽在生物體系中扮演著至關(guān)重要的角色，并且它們是許多重要治療藥物的構(gòu)成要素。然而，這些生物分子的研究進(jìn)展常常受到基于時(shí)間密集型表達(dá)技術(shù)和原生化學(xué)連接方法的限制。固相多肽合成（SPPS）為直接合成具有特定序列的蛋白質(zhì)提供了一種途徑，并能夠迅速產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。盡管如此，由于在合成過程中雜質(zhì)的累積和產(chǎn)物聚集的傾向，長(zhǎng)肽和蛋白質(zhì)的SPPS合成面臨著不小的挑戰(zhàn)。在早期，SPPS主要被應(yīng)用于生產(chǎn)較短的片段，以便進(jìn)行原生化學(xué)連接，而對(duì)于較長(zhǎng)序列的合成能力相對(duì)受限[1]。近來，快速流動(dòng)式合成方法展示了其以極短周期時(shí)間組裝長(zhǎng)序列的顯著潛力。但這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，它需要使用大量的氨基酸（通常是≥ 100當(dāng)量），并且伴隨著大量廢物的產(chǎn)生。
微波加熱技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被普遍應(yīng)用于多肽合成，并且已經(jīng)證實(shí)其能夠有效地克服肽鏈聚集的難題，并促進(jìn)困難反應(yīng)的順利進(jìn)行[3,4]。通過結(jié)合優(yōu)化的碳二亞胺耦合條件和微波加熱（CarboMAX™ 技術(shù)），可以實(shí)現(xiàn)最小程度的差向異構(gòu)化，并且與傳統(tǒng)使用鏻鹽和強(qiáng)堿的更為激烈激活方法相比，能夠?qū)崿F(xiàn)更高純度的合成效果。此外，采用無需中間排放步驟的一鍋法耦合和脫保護(hù)流程，使得整個(gè)過程更加迅速和高效。
在2022年，推出了新一代的微波肽合成器系列——Liberty PRIME 2.0和Liberty Blue 2.0。這些先進(jìn)設(shè)備采用了創(chuàng)新的頂部沖洗技術(shù)，該技術(shù)在肽合成過程中能夠保持反應(yīng)容器表面的清潔度。通過預(yù)防揮發(fā)性試劑的再冷凝，頂部沖洗技術(shù)有效避免了對(duì)后續(xù)反應(yīng)的污染。隨著長(zhǎng)蛋白質(zhì)合成的進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)步驟中即使是微小的純度提升也會(huì)累積起來，最終轉(zhuǎn)化為整體純度的顯著提高。利用Liberty PRIME 2.0，成功合成了一系列具有挑戰(zhàn)性的蛋白質(zhì)，包括76個(gè)氨基酸的泛素、86個(gè)氨基酸的胰島素原、89個(gè)氨基酸的巴氏蛋白、99個(gè)氨基酸的類膠原蛋白序列和HIV蛋白酶，以及127個(gè)氨基酸的MDM2。
圖1. Liberty PRIME 2.0
蛋白質(zhì)合成流程經(jīng)過精心優(yōu)化，僅需要10到20當(dāng)量的氨基酸，平均每個(gè)合成周期只需大約7.5分鐘，這樣的高效率使得目標(biāo)蛋白可以在一晚上的時(shí)間內(nèi)（每輪運(yùn)行10至17小時(shí)）以較高的初始純度完成合成。到了第二天，所合成的蛋白質(zhì)便被分離并轉(zhuǎn)移到Prodigy純化系統(tǒng)，在那里它們通過60°C的升溫色譜法得到進(jìn)一步凈化。這一氵?程不僅速度迅捷，而且試劑的使用也木及具效率（詳見表1）。
材料與方法
試 劑
從CEM Corporation（Matthews, NC）獲得的以下Fmoc氨基酸包含所示的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Ala, Asn(Trt), Arg(Pbf), Asp(OMpe), Asp(OtBu)-(Dmb)Gly, Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Gly, His(Boc), Ile, Leu, Lys(Boc), Phe, Pro, Met, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), 和 Val。Rink Amide ProTide™ LL樹脂（0.20 meq/g替代）也來自CEM Corporation。N,N’-二異丙基碳二亞胺（DIC）、吡咯烷、三氟乙酉夋（TFA）、3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT）和三異丙基硅烷（TIS）來自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、無水乙酉迷（Et2O）和乙酸來自VWR（West Chester, PA）。LC-MS級(jí)水（H2O）和LC-MS級(jí)乙腈（MeCN）來自Fisher Scientific（Waltham, MA）。
蛋白質(zhì)合成
蛋白質(zhì)合成在CEM Liberty PRIME 2.0自動(dòng)化微波肽合成儀上進(jìn)行，采用Rink Amide ProTide® LL樹脂，合成規(guī)模為0.05或0.1毫摩爾。脫保護(hù)步驟使用DMF中的吡咯烷進(jìn)行處理。偶聯(lián)反應(yīng)則通過使用10或20當(dāng)量的Fmoc保護(hù)氨基酸與DIC和Oxyma Pure在DMF中反應(yīng)（遵循改良的CarboMAX方案）。蛋白質(zhì)的切割在室溫或38°C下進(jìn)行，使用的是TFA/H2O/TIS/DODT混合物。切割完成后，蛋白質(zhì)通過乙酉迷沉淀并經(jīng)過夜凍干處理以獲得最終產(chǎn)品。
蛋白質(zhì)純化
蛋白質(zhì)通過裝備有Intrepid C18, 21.2 mm x 250 mm, 5 μm色譜柱的Prodigy系統(tǒng)上的高溫HPLC進(jìn)行純化。粗蛋白首先溶解在水中并過濾后注射進(jìn)樣。分離在40或60°C下進(jìn)行，使用含有0.1% TFA的(i)水和(ii)乙腈的梯度洗脫。
蛋白質(zhì)分析
蛋白質(zhì)在裝備有Q Exactive plus MS的ThermoFisher UPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析，使用Acquity UPLC BEH C8色譜柱（1.7 mm x 100 mm）。峰分析在Chromeleon軟件上完成。分離使用含有0.05% TFA的(i)水和(ii)乙腈的梯度洗脫進(jìn)行。
成 果
表1. 每種蛋白質(zhì)的合成時(shí)間和產(chǎn)生的廢液總量
表2. 每個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列
加粗的DG表示使用了Asp(OtBu)-(DMB)Gly
結(jié) 論
微波固相肽合成（Microwave SPPS）技術(shù)已證明是一種用于合成大型肽鏈和蛋白質(zhì)的強(qiáng)大且高效的方法。在Liberty PRIME 2.0設(shè)備上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)展示了其能力，成功合成了六種不同長(zhǎng)度（從76至127個(gè)氨基酸）的蛋白質(zhì)。這一自動(dòng)化過程僅需10至17小時(shí)即可完成單個(gè)蛋白質(zhì)的合成，并且目標(biāo)蛋白質(zhì)能夠通過Prodigy系統(tǒng)的高溫制備型HPLC迅速純化出來。與天然化學(xué)連接或蛋白質(zhì)表達(dá)的傳統(tǒng)方法相比，這種快速且方便的替代方案提供了顯著的效率優(yōu)勢(shì)。此外，Liberty PRIME 2.0和Liberty Blue 2.0系統(tǒng)具有高度適應(yīng)性，可用于引入非天然氨基酸或制備特殊蛋白質(zhì)。整個(gè)組裝過程不僅速度快、效率高，而且產(chǎn)生的廢物極少，顯示出其*的環(huán)保性能。
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圖1.泛素樣品粗制（1、2）和純化后（3、4）的UPLC-MS 分析
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圖2.原胰島素粗樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析
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圖3.芽孢桿菌RNA酶樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析
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圖4.艾滋病毒蛋白酶樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析
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圖5.膠原蛋白樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析
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圖6.MDM2樣品粗制(1、2)和純化后(3、4)的 UPLC-MS 分析
參考文獻(xiàn)
[1] Hou, W.; Zhang, X.; Liu, C.-F., Progress in Chemical Synthesis of Peptides and Proteins. Transactions of Tianjin University 2017, 23 (5), 401-419.
[2] Hartrampf, N.; Saebi, A.; Poskus, M.; Gates, Z. P.; Callahan, A. J.; Cowfer, A. E.; Hanna, S.; Antilla, S.; Schissel, C. K.; Quartararo, A. J.; Ye, X.; Mijalis, A. J.; Simon, M. D.; Loas, A.; Liu, S.; Jessen, C.; Nielsen, T. E.; Pentelute, B. L., Synthesis of proteins by automated flow chemistry. Science 2020, 368(6494), 980-987.
[3] Bacsa, B.; Horváti, K.; B?sze, S.; Andreae, F.; Kappe, C.O., Solid-Phase Synthesis of Difficult Peptide Sequences at Elevated Temperatures: A Critical Comparison of Microwave and Conventional Heating Technologies. J. Org. Chem. 2008, 73 (19), 7532-7542.
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[5] CEM: CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperatures. CEM Corporation Website, Application Notes.[Online]. Published Online: January 9, 2018.
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