Treponema pallidum IgG ELISA
Treponema pallidum IgG ELISA標(biāo)本必須為液體,不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個(gè)標(biāo)本量收集體積=100ul×檢測(cè)種類(lèi)。
培養(yǎng)基 :"*培養(yǎng)基有售,用我們乾思生物的*培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)更省心!"
供應(yīng)商 :乾思生物
貨期 :7-10天
1. 試劑準(zhǔn)備:所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。 實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
2. 加樣:加樣或加試劑時(shí),請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時(shí),前一個(gè)孔與后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育"時(shí)間,從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。
3. 孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。
4. 洗滌:洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5. 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請(qǐng)確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測(cè)溶液A時(shí),一次不要小于10μl),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。
6. 反應(yīng)時(shí)間的控制:加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7. 底物:底物請(qǐng)避光保存,在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以稀釋倍數(shù)。
洗板方法
1. 手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
2. 自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析,如curve expert 1.3,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
◇ 液體類(lèi)標(biāo)本
標(biāo)本必須為液體,不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個(gè)標(biāo)本量收集體積=100ul×檢測(cè)種類(lèi)。
◇ 血清:
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇ 血漿:
應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,加入10%(v/v)抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇ 尿液、胸腹水、腦脊液:
用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇ 細(xì)胞培養(yǎng)上清:
檢測(cè)分泌性的成份時(shí),用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
在生物制品方面,我公司是世界衛(wèi)生組織下屬生物標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)室(英國(guó)生物制品檢定所NIBSC和荷蘭VQC)、歐洲藥品質(zhì)量監(jiān)察會(huì)(EDQM)在中國(guó)的進(jìn)口商,同時(shí)我部門(mén)也在代理進(jìn)口一些其他菌種保藏機(jī)構(gòu)的產(chǎn)品,比如德國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(DSMZ)、英國(guó)國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心(NCTC)等,為國(guó)內(nèi)科研以及生產(chǎn)用戶(hù)提供細(xì)胞株、菌株等生物標(biāo)準(zhǔn)品。
收到后,取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
(一)如果細(xì)胞未長(zhǎng)滿(mǎn),用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺(tái)內(nèi),嚴(yán)格無(wú)菌操作,打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,吸出培養(yǎng)液,僅留下10ml培養(yǎng)液在瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(二)如果細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn),即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下:
1. 棄去培養(yǎng)液,用PBS(不含鈣,鎂離子)洗1-2次。
2. 加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1-3分鐘預(yù)熱,然后又將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30秒后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓分散,輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶,細(xì)胞隨即脫落下來(lái)。
3. 加入6-8ml*培養(yǎng)基,吸出,分到新的培養(yǎng)瓶中。一傳二。
注意:傳代后一半用我們的培養(yǎng)基,一半用你們的,以免細(xì)胞不適應(yīng)而造成生長(zhǎng)不好。
無(wú)菌操作注意事項(xiàng):
1)操作前要洗手,進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2)點(diǎn)燃酒精燈,操作在火焰附近進(jìn)行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng),以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3)操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動(dòng),增加污染機(jī)會(huì)。
4)不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺(tái)面上用品要布局合理。
5)瓶子開(kāi)口后要盡量保持45℃斜位。
6)吸溶液的吸管等不能混用。
標(biāo)準(zhǔn)蛋白表達(dá)服務(wù)
1. 克隆目標(biāo)蛋白編碼序列到合適的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上;
2. 制備重組bacmid DNA;
3. bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞,制備P1和P2病毒stock;
4. P2病毒滴度測(cè)定
5. 重組蛋白表達(dá)評(píng)估和條件優(yōu)化;
6. 小規(guī)模蛋白表達(dá)和純化(500 ml培養(yǎng)物);
7. 大規(guī)模蛋白表達(dá)和純化(可選)。
病毒制備服務(wù)
1. 克隆目標(biāo)蛋白編碼序列到合適的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上;
2. 制備重組bacmid DNA;
3. bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞,制備P1和P2病毒stock;
4. P2病毒滴度測(cè)定(滴度108-109);
5. 蛋白表達(dá)驗(yàn)證;
6. P3病毒制備(可制備3L重組桿狀病毒)。
注意事項(xiàng)
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值),請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請(qǐng)避光保存。
7.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9.本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
現(xiàn)在一般完整的試劑盒應(yīng)該有一下幾個(gè)組成:
(1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);
(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物);
(3)酶的底物;
(4)陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品(定性測(cè)定中),參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清(定量測(cè)定中);
(5)結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液;
(6)洗滌液,在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水;
(7)酶反應(yīng)終止液,常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的體積而異,在板式ELISA中一般采用3mol/L。
1.基因工程的酶和試劑; PCR酶,DNA連接酶,RNA酶?等
2.生物化學(xué)酶
3.人類(lèi)和模式生物的基因文庫(kù)
4.與DNA重組,復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)及相關(guān)抗體
5.生長(zhǎng)因子
6.細(xì)菌蛋白質(zhì)毒素和抗體
7. HIV-1重組蛋白和抗體
8.抗體; Trsanscription因子和RNA加工
9.抗體; 癌癥,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
10.抗體; 免疫學(xué)
11.抗體; 染色體,細(xì)胞分裂和檢查點(diǎn)
12.抗體; 表觀遺傳學(xué)和染色質(zhì)
13; 抗體; 蛋白酶體,泛素和SUMO
14.抗體; 分化,胚胎學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)
15.抗體; 生物學(xué)
16.抗體; 腦和神經(jīng)科學(xué)
17.抗體; 病毒和感染因子
18.抗體; 植物生物學(xué)(即將上市)
19.雜項(xiàng); 細(xì)胞系.LeukoCatch(去除和收集白細(xì)胞)
20.定制服務(wù):蛋白質(zhì)結(jié)合單克隆抗體。
洗板方法
1. 手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
2. 自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析,如curve expert 1.3,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。