目錄:北京索萊寶科技有限公司>>酶>>酶>> E010050 Uracil-DNA Glycosylase 尿嘧啶糖基化酶
產(chǎn)品介紹：
尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG）來源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)，分子量為25kDa，可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶。UNG酶對RNA無活性，主要應(yīng)用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。其作用原理基于：如果在PCR反應(yīng)中以dUTP替代dTTP摻入DNA中，形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物。
規(guī)格：1U/μl
儲存緩沖液：
20mM Tris-HCl(pH8.0，25℃)，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，0.05% Tween20，50%glycerol.
試劑組成：
10×Reaction Buffer：200mM Tris-HCl(pH8.0，25℃)，100mM NaCl，10mM EDTA，1mg/ml BSA.
活性定義：
37℃條件下，1小時降解1μg含dU堿基的單鏈DNA的酶量為1單位。
保存條件：
每天或每周使用保存于-20℃。長期儲存應(yīng)保存于-70℃保存，并嚴(yán)格避免-70℃保存時反復(fù)凍融。
質(zhì)量控制：
1、SDS-PAGE電泳純度大于98%；
2、1U UNG在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模版應(yīng)*降解，不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、無核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶活性、RNase酶活性；
（1）SDS-PAGE 銀染純度大于98%
（2）UNG 酶消化能力試驗
以700bp含dUTP的不同拷貝數(shù)基因片段為模板，分別加入含0.5U UNG酶的50μl PCR反應(yīng)體系，50℃ 消化2min，94℃ 滅活4min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
A. Biori UNG
B. Promega UNG
Lane 1：Negative control （no template）；
Lane 2：positive control（no UNG）；
Lane 3~lane 10: 103 to 1010 copies of template
結(jié)果表明，我們的UNG酶與Promega UNG酶消化效果相當(dāng)，均可以有效控制108拷貝以下含有U-DNA的模板的污染。
（3）UNG酶穩(wěn)定性實驗
將UNG酶置于37℃進(jìn)行7天加速試驗。以含dUTP的（106、107、108、109 copies/ml）基因為模板，采用含dUTP的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μl反應(yīng)體系加入0.5U UNG酶，于50℃消化2min，94℃滅活4min；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以Promega公司UNG酶為對照，考察UNG酶對模板的消化效果。
1：negative（No template）；
2～9：postive （104、105、106、107、108、109、1010、1011 copies /ml， No UNG）；
10～14：control Promega UNG（106、107、108、109、1010 copies /ml）；
15～19：Sample UNG（106、107、108、109、1010 copies/ml）。
1～4：Sample UNG（106、107、108、109 copies/ml）；
5～8：Control Promega UNG（106、107、108、109 copies/ml）；
9：negative （No template）；
10～13：Postive （106、107、108、109 copies/ml，No UNG）。
結(jié)果表明，我們的UNG酶與Promega UNG酶穩(wěn)定性相當(dāng)，均可以在37℃加速7天，仍保持對107copies/ml含dUTP模板的消除能力。
反應(yīng)條件：
Component | Volumeper Reaction（μl） | Concentration in Master Mix |
Template | * | < 1μg/reaction |
Primer1 | 1~5 | 0.2~1.0μM |
Primer 2 | 1~5 | 0.2~1.0μM |
d NTPs （replace dTTP for 150μM~600μM dUTP） | 1 | 150μM （dATP、dGTP、dCTP） |
10×PCR Buffer | 5 | 1× |
25mM MgCl2 | 2~8 | 1.0~4.0mM |
Taq（5U/μl） | 0.25 | 1.25U |
UNG（1U/μl） | 0.25 （0.1~0.5） | 0.25U （0.1~0.5U） |
H2O | * | —— |
Total volume | 50μl |
1、Incubate the product for 2 min at 50℃；
2、Inactivate UNG by heating to 95℃ for 5 min.
注意事項：
1、避免多次凍融，切勿暴露在溫度波動較大之處。溫度波動對產(chǎn)品的穩(wěn)定性有極大影響。
2、尿嘧啶DNA糖基酶可以在PCR反應(yīng)前清除不慎污染的U-DNA分子。為有效防止污染，一個實驗室必須在所有的PCR反應(yīng)中均使用dUTP作為dNTPs組分之一進(jìn)行擴(kuò)增，使所有擴(kuò)增產(chǎn)物都成為U-DNA。
3、由于不同基因堿基組成不同，因此有些基因?qū)?/span>UNG酶殘留活性十分敏感，如發(fā)現(xiàn)使用UNG 酶影響擴(kuò)增靈敏度，可以嘗試降低UNG酶的用量或?qū)Ψ磻?yīng)體系中dTTP與dUTP的比例進(jìn)行調(diào)整。推薦使用我公司生產(chǎn)的TS-UNG，該酶滅活更加*，可以大大簡化上述試驗過程。
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