上手蛋白定量實(shí)驗(yàn)，我們有招兒

時(shí)間：2021/12/24閱讀：1384

蛋白定量是生物學(xué)研究中不可能或缺的一個(gè)步驟，根據(jù)其目的可分為蛋白質(zhì)的“總定量"和特定蛋白的“個(gè)別定量"。在蛋白質(zhì)的提取、純化和分析過程中，蛋白質(zhì)的定量隨處可見。比如在裂解細(xì)胞之后，應(yīng)對(duì)各個(gè)樣品中的蛋白進(jìn)行定量，確保下游實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平行度；在電泳之前進(jìn)行定量，保證上樣量一致，這樣目的條帶含量的變化才有說服力。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能各一、分子量存在巨大差異，目前還沒有一個(gè)理想且通用的蛋白定分析方法。如今最常見的方法主要有以下幾種：

BCA法測定

bicinchonininc acid

原理

BCA(bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即 BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+,一個(gè)Cu*螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。

特點(diǎn)

靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25ug/ml，最小檢測蛋白量達(dá)到0.5ug，待測樣品體積為1-20ul 。
測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton x-100，5%的Tween 20，60， 80。
在20-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。
受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響:EDTA小于10mM。DTT小于1mM疏基乙醇低于1mm。
BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。

優(yōu)缺點(diǎn)

操作簡單，快速，45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便;
準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA 試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是20-200ug/ml ,微量BCA測定范圍在0.5-10ug/ml。
經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量;
抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無影響

考馬斯亮蘭法

bradford

原理

考馬斯亮藍(lán)（CBB)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?/span>蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm 波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含

量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比 Lowry法還高4倍，可測定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0~1 000ug/ml ,是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高，據(jù)估計(jì)比 Lowry 法約高四倍，蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1ug。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)–染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。
測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而*不用像Lowry 法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。
干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、疏基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

缺點(diǎn)：

由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用v一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、Triton x-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N 的酸干擾 Lowary法一樣)
標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。

紫外分光光度法測定

bradford

原理

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長處，在最大吸收波長處，吸收光度與蛋白質(zhì)溶液濃度的關(guān)系服從朗伯-比爾定律，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、靈敏、快速、高選擇性，且穩(wěn)定性好，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定。

缺點(diǎn)：儀器昂貴，而且不同的蛋白質(zhì)的紫外吸收是不相同的，測定結(jié)果存在著一定的誤差，受光源、溶液的PH值、比色皿材質(zhì)、緩沖介質(zhì)溶液等因素的影響和限制。

Lowary蛋白定量法

Lowary

原理

Lowary法是雙縮脲法和福林酚法的結(jié)合與發(fā)展，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理，形成銅-蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽，在加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強(qiáng)烈。因此，Lowary法的顯色效果比單獨(dú)使用酚試劑強(qiáng)烈3-15倍，為雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減小了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：微克級(jí)高靈敏度定量測定，穩(wěn)定。

缺點(diǎn)：

受植物體內(nèi)存在的酚類物質(zhì)干擾。
去污劑如TritonX-100，SDS，NP-40的濃度超過0.2%時(shí)會(huì)影響定量結(jié)果。

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