6、24、96孔板接種和換液問題

細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等，孔的底部可以選擇平的、圓的，或錐形的，這取決于細(xì)胞類型和下游應(yīng)用。對(duì)于傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)(如HeLa或MDCK細(xì)胞)，特別是需要對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行成像或分光光度測定，通常選平底(F-bottom)。對(duì)于不存在接觸抑制的細(xì)胞，弧形底(C-bottom)也不錯(cuò)。圓底(U-bottom)適合懸浮培養(yǎng)(如球體細(xì)胞培養(yǎng))，因?yàn)閳A的表面讓細(xì)胞難以附著和生長。而錐形底很少用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，但在細(xì)胞沉淀時(shí)可能有用。

以下主要為大家介紹6、24、96孔板接種和換液問題。

6孔板接種和換液問題

問題1：細(xì)胞傳代很正常，但一種到六孔板里(不管加藥和對(duì)照)，總有兩三個(gè)孔(隨機(jī))細(xì)胞長得不好，很小，像破碎了。有人遇到過這種情況嗎?到底是啥原因呢?

答：可能跟加液的溫度有關(guān)。如果細(xì)胞剛剛拿出來換液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久，很容

易細(xì)胞就會(huì)凍死了。建議最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。

另外，跟細(xì)胞的生長狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀態(tài)良好。

或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問題，再換換其他培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問題了，種板時(shí)的血清濃度調(diào)高試一下。

問題2：用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個(gè)孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細(xì)胞一切正常，異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺，上半個(gè)圓是好的，下半個(gè)圓就不好，這是怎么一回事?

答：1.可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平。

    2.培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過期，細(xì)胞就不會(huì)貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試。

    3.可能是板的問題，換一個(gè)牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。

    4.所需換液的培養(yǎng)板多不多，換培養(yǎng)基的時(shí)候如果沒有注意風(fēng)機(jī)的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時(shí)，容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時(shí)應(yīng)該逐個(gè)培養(yǎng)板進(jìn)行，別怕浪費(fèi)吸管，注意操作的效率!

24孔板接種問題

問題1：把細(xì)胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長不滿，每天換液時(shí)都用PBS 清洗，第二天換液時(shí)都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長的很好，中央大量死細(xì)胞，也不知道是什么原因？

答：是中央長不滿，還是中央有和邊緣相同密度的細(xì)胞，但是大部分都是死細(xì)胞?如果是前者，也許不是技術(shù)問題，而是物理問題了。

選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，是必要的步驟嗎?另外，也有可能和細(xì)胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)?

如果培養(yǎng)液加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊緣液體會(huì)向上走，造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個(gè)凹面(就像量筒的液體凹面一樣)，中央的細(xì)胞正好在凹面的Lowest處，培養(yǎng)液少，細(xì)胞的營養(yǎng)不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會(huì)造成損傷，即使有增值過來的細(xì)胞也會(huì)死掉。

另外，檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，如果少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會(huì)造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過一段時(shí)間，由于蒸發(fā)，液體量會(huì)減少，造成中央干涸。并且這樣會(huì)改變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過高。

個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問題：24孔板小，細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況。

至于中間較多死細(xì)胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對(duì)搖均勻細(xì)胞有一定效果。

在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果全部吸取，很容易造成細(xì)胞干涸，這樣的話細(xì)胞會(huì)很快死亡。

同時(shí)細(xì)胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因

1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問題。

2.細(xì)胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周圍。

問題2：細(xì)胞在接種在24孔板上時(shí)，孔的周圍細(xì)胞密集，中間細(xì)胞稀少，試了很多次均如此。請問怎樣操作才能使細(xì)胞分布均勻?

答：這種情況一般是種板時(shí)培養(yǎng)液過少，液面總是呈一凹面，如果液面過低，孔中間就基本上沒什么細(xì)胞，所以種板時(shí)一定不能吝嗇培養(yǎng)液，待貼壁后可以用比較少量的培養(yǎng)液處理

周圍細(xì)胞稀少，中間細(xì)胞密集:這種情況一般是種板后過于晃動(dòng)，特別是旋轉(zhuǎn)著晃動(dòng).有人才用十字方向的晃動(dòng)方法使細(xì)胞分散均勻.但本公司研究人員認(rèn)為，將細(xì)胞加入孔后，用槍或移液器充分吹打混勻后就不用，也不能再晃動(dòng)，甚至拿著孔板走路帶來的震動(dòng)都會(huì)讓細(xì)胞往中間集中。

當(dāng)然，無論是哪種情況，首先都需要保證細(xì)胞在種板時(shí)時(shí)均勻分布的，即種板時(shí)的細(xì)胞懸液一定要混勻。

根據(jù)細(xì)胞的特性，細(xì)胞均喜歡聚集在邊緣生長，所以考慮到，還有可能是接種時(shí)的細(xì)胞密度不夠，導(dǎo)致周邊密集，中間稀疏的錯(cuò)覺。

另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"。加樣不能太快，避免細(xì)胞在一個(gè)加樣處聚集，且注意在不同的部位進(jìn)行加樣，即邊加邊活動(dòng)槍頭，人為使細(xì)胞趨于均勻分布。

96孔板細(xì)胞接種換液和收集細(xì)胞

問題1：用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果細(xì)胞長得不是很理想，不是長得不均勻，就是每個(gè)孔細(xì)胞生長速度不一樣。另外，鏡下觀察細(xì)胞輪廓很不清晰，怎么調(diào)焦距效果都不好。(板子是剛拆封的。)不知道怎么回事?

答：首先要盡可能把消化細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞(不要成團(tuán))，反復(fù)吹打，掌握好時(shí)間(不同的細(xì)胞要摸索的)，種細(xì)胞時(shí)要均勻的吸取，清清的吹打一遍再吸取細(xì)胞，這樣也許會(huì)解決問題。

種到96孔板的細(xì)胞一定要消化成單個(gè)細(xì)胞，建議用EDTA和胰酶消化。加血清后反復(fù)吹打。細(xì)胞量盡量少一點(diǎn)。

提議：

1、對(duì)細(xì)胞的選擇要注意，要選擇狀態(tài)好的細(xì)胞，密度要選分布瓶底80%為宜；

2、消化時(shí)，不要忘了用PBS(或純的不含血清的培養(yǎng)基)洗一遍，加0.25%的胰酶1ml消化2-3分鐘(不同的細(xì)胞有差別，要摸索)，還要不時(shí)的活動(dòng)，讓胰酶分布到每個(gè)角落，之后傾去胰酶，加3ml培養(yǎng)基(加血清過于粘稠，不宜吹打，加培養(yǎng)基后稀釋胰酶可不考慮對(duì)細(xì)胞的損傷)，吹打成單個(gè)細(xì)胞；

3、接種時(shí)要注意細(xì)胞密度，多數(shù)細(xì)胞要求0.5-2的10的4次冪，這也要摸索一下(簡單：就是種一個(gè)密度，如果在測指標(biāo)時(shí)細(xì)胞沒過多影響結(jié)果就行)；

4、周邊的孔不要做指標(biāo)檢測孔，有沒有發(fā)現(xiàn)周邊的孔的細(xì)胞2天后狀態(tài)就明顯不好了；

5、接種細(xì)胞調(diào)整好濃度后，要一邊吹細(xì)胞懸液一邊接種；

6、還有看不清細(xì)胞，注意到?jīng)]有，當(dāng)把培養(yǎng)板拿出孵箱一會(huì)，培養(yǎng)板蓋就有一層霧，會(huì)影響觀察細(xì)胞，是不是這個(gè)問題?

問題2：在96孔培養(yǎng)板上接種的細(xì)胞很均勻，但換液時(shí)，用槍加150ul的培養(yǎng)基加入每個(gè)孔內(nèi)，結(jié)果在顯微鏡下觀察周邊細(xì)胞全被沖到孔中央去了，而中間的細(xì)胞層疊成致密的團(tuán)塊，請問這樣的細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響嗎?有其他的好辦法嗎? 是3T3-L1前脂肪細(xì)胞，要進(jìn)行誘導(dǎo)分化成成熟脂肪細(xì)胞。所以每次換液總把握不好。請問有誰有這方面的經(jīng)驗(yàn)嗎?

答：我們實(shí)驗(yàn)室一般用機(jī)械吸引器吸引，吸引器管前面套一個(gè)20ul加樣器的Tip頭，效果不錯(cuò)，操作在無菌臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。Tip頭剪去Tip后滅菌使用，加液時(shí)液體呈滴狀滴入，就不會(huì)擾動(dòng)孔底的細(xì)胞了。

建議：加液的時(shí)候沿著邊輕輕的加入，動(dòng)作柔和，可以避免沖動(dòng)細(xì)胞；去液的時(shí)候直接甩板，方便快捷。

去液的時(shí)候不建議直接甩板，容易污染?？梢约舻魌ip尖，不能直接沖細(xì)胞，沿孔壁輕輕加入，液體提前在孵箱里預(yù)熱10分鐘，有時(shí)候液體涼也會(huì)使細(xì)胞掉下來。

在96孔板中誘導(dǎo)細(xì)胞換液一般采用半量換液，這樣細(xì)胞就不會(huì)被沖走了，至于換液的間隔與細(xì)胞有關(guān)，如果卷得特別厲害，很可能是細(xì)胞的問題，建議更新細(xì)胞株。

問題3：細(xì)胞對(duì)胰酶和EDTA不管用.高濃度胰酶可以，但細(xì)胞存活率不高，有沒有小的細(xì)胞刮匙，(或者自制刮匙的方法)，可以用于96孔板?(在建細(xì)胞系，非得用96孔板)。

答：一般情況下細(xì)胞在一次性培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中貼壁較緊，都不太好消化，如果建系的話最好不用刮的方法，還是消化比較好!消化時(shí)以下幾點(diǎn)注意了嗎?

消化前用D-Hanks沖洗了嗎?可以沖洗2-3遍。

適當(dāng)增加胰酶濃度，提高胰酶PH值到8，減少消化時(shí)間應(yīng)該對(duì)細(xì)胞影響不大。消化時(shí)放入37度培養(yǎng)箱。

如果細(xì)胞還是消化不下來可加適量膠原酶，有的細(xì)胞對(duì)膠原酶敏感。

問題4：D-Hanks和PBS沖洗效果有何不同?在胰酶消化前一直用PBS沖洗。

答：首先，D-Hanks和PBS沖洗細(xì)胞都可以的，不過嚴(yán)格來說D-Hanks更好，因?yàn)橐让甘怯肈-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改變胰酶的消化環(huán)境。

第二個(gè)問題，可以不用wash，加入帶血清的培養(yǎng)基之后胰酶將沒有作用，但是如果EDTA濃度太高的話就需要wash了。