內分泌腺來源血管內皮生長因子(EG-VEGF)檢測試劑盒

適用生物 Homo sapiens (Human，人)
檢測范圍 15.63-1000pg/mL 靈敏度 5.9pg/mL
樣本類型 Serum, plasma, tissue homogenates, cell lysates, cell culture supernates and other biological fluids.
實驗時長 4.5h 實驗方法 雙抗夾心法
規(guī)格 96T

內分泌腺來源血管內皮生長因子(EG-VEGF)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)
適用生物：人
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
內分泌腺來源血管內皮生長因子(EG-VEGF)檢測試劑盒[預期應用]
本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA 法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生
物液體中EG-VEGF 含量。
[試劑盒內容]
試劑名稱數(shù)量試劑名稱數(shù)量
96孔板(預包被) 1 96孔板覆膜4
標準品2 標準品稀釋液1×20mL
檢測溶液A 1×120μL 檢測稀釋液A 1×12mL
檢測溶液B 1×120μL 檢測稀釋液B 1×12mL
TMB底物1×9mL 終止液1×6mL
濃洗滌液(30×) 1×20mL 使用說明書1
[需自備的設備及試劑]
1、450±10nm 濾光片的酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)
2、單道或多道微量加液器及吸頭
3、稀釋樣品的EP 管
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
6、盛放洗液的容器
[試劑盒的儲存及有效期]
1、未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標準品、檢測溶
液A、檢測溶液B 以及96 孔板保存于-20oC。
2、使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于
-20oC，避免潮濕。
注意：
試劑盒內酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在實驗后1 個月內使用完畢。
產品過期時間以盒子上的標簽為準，保質期內所有組分都確保是穩(wěn)定的。
[標本的采集與保存]
1、血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2 小時或4oC ，然后1000×g 離心20 分鐘，取上清即
可，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
2、血漿：用EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30 分鐘內于2-8oC 1000×g 離心15 分鐘，
取上清即可檢測，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
3、組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后
再勻漿）；
2） 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預冷PBS 進行充
分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融
進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2 次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。
4、細胞裂解液：
1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）；
2）將收集到的細胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反復凍融）：
i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。
ii 反復凍融：將待破碎的細胞在-20oC 以下冰凍，室溫融解，反復3 次，使細胞溶脹破碎。
4）將標本于2-8oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。
5、細胞培養(yǎng)上清或其它生物標本：請1000×g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20oC 或-80oC 保
存，但應避免反復凍融。
注意：
1、以上標本均需密封保存，4oC 保存應小于1 周，-20oC 不應超過1 個月，-80oC 不應超過2 個月。
2、標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
3、標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。
[試劑準備]
1、使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC 溶解。
2、標準品(凍干品)：每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10 分鐘，同時反復顛倒/搓動以
助溶解，其濃度為4,000pg/mL(貯液)。先將其稀釋為1,000pg/mL(標準曲線zui高濃度)后，再準備7 個稀釋
標準品的EP 管，每個EP 管中加入500μL 的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成1,000pg/mL, 500pg/mL,
250pg/mL, 125pg/mL, 62.5pg/mL, 31.2pg/mL, 15.6pg/mL，標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保
證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pg/mL 4,000 1,000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 0
3、檢測溶液A 及檢測溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或
瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A 或B1:100 稀釋(如：10μL 檢測溶液A/990μL 檢測稀釋
液A)，充分混勻，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100μL/孔)，實際配制時應多配制
0.1-0.2mL。
4、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進行30 倍稀釋。
5、底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應予丟棄，
不要倒回TMB 瓶中。
注意：
1、標準品的稀釋不能直接在板中進行。
2、標準品請于臨用前15 分鐘內配制。該標準品只能使用一次。
3、標準品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混淆?；靹驎r要輕輕充分混
勻，避免起泡。為保證實驗結果的準確請使用微量吸管，并校準微量加液器。請依據(jù)所需的量配制，盡
量不要微量配制(如吸取檢測溶液A 時，一次不要小于10μL)，以避免造成濃度誤差。
4、請勿重復使用已經(jīng)稀釋過的標準品、檢測溶液A 工作液和檢測溶液B 工作液。
5、濃洗滌液中如有結晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結晶*溶解再進行配制。
6、試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質量差或水質污染，以
及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結果不準確，甚至*錯誤，請使用雙蒸水。
[標本處理]
1、本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本
的可能使用量，預留充足的樣本。
2、實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，
計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。標本使用0.01mol/L 的PBS 稀釋(PH=7.0-7.2)。
3、若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。
4、使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致ELISA 實驗結果偏差。
5、若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存
在檢測不出的情況。
6、某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹
配，而不被檢測出。
7、建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導致實驗結果偏差。
[操作步驟]
1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7 孔，依次加入100μL 不同濃度的標準品(見試劑準
備2)?？瞻卓准?00μL(見試劑準備第二步zui后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37oC 溫
育2 小時。
2、棄去液體，甩干，不用洗滌。
3、每孔加檢測溶液A 工作液100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37oC 溫育1 小時。
4、棄去孔內液體，每孔用350μL 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，
在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內液體拍干)，重復洗板3 次。zui后一次
洗滌后，要把孔內的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。
5、每孔加檢測溶液B 工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 溫育30 分鐘。
6、棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟4。
7、每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37oC 避光顯色(反應時間控制在15-25 分鐘，不要超過30 分鐘。
當標準孔的前3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯時，即可終止)。
8、每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相
同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
9、在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm 波長測量各孔的光密度(O.D.值)。
注意：
1、試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下
次使用。
2、加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，
盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，
將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間(包括
標準品及所有樣品)控制在10 分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進
行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌
液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后
的酶標儀讀數(shù)。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
5、反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10 分鐘觀察一次)，如顏色較深，
請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
6、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、如果實驗室內濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。
[實驗原理]
將EG-VEGF 抗體包被于96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的EG-VEGF 與連
接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的EG-VEGF 抗體，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP 標
記的親和素，再次*洗滌后加入TMB 底物顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化
成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的EG-VEGF 呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(O.D.值)，計算
樣品濃度。
[計算]
各標準品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點圖)，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度
為縱坐標(或對數(shù)坐標)，O.D.值為橫坐標(或對數(shù)坐標），繪出標準曲線(*方程式應依回歸方程計算的R2值來定，
以R2 值越趨近于1 為好)。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.30，根據(jù)樣品O.D.值，由標
準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與O.D.值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的
O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
[典型數(shù)據(jù)]
為了便于計算，盡管濃度為自變量而O.D.值為因變量，我們繪圖時仍采用標準品的O.D.值作為橫坐標(X 軸)，標準
品的濃度為縱坐標(Y 軸)。同時為了試驗結果的直觀性，圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。推薦使用對數(shù)
值建立標準曲線圖。由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和溫度條件等），標準曲線的
O.D.值會有所差異。所提供的標準曲線僅供參考，實驗者需要根據(jù)自已的實驗建立標準曲線。
人內分泌腺來源血管內皮生長因子(EG-VEGF)檢測試劑盒標準曲線
[檢測范圍]
15.6pg/mL-1,000pg/mL
[zui低檢測限]
5.9pg/mL
此值為20 個空白樣品(即標準品稀釋液)測定的平均值加二倍標準差所對應的濃度。
[特異性]
本試劑盒用于檢測EG-VEGF，經(jīng)檢測與其它相似物質無明顯交叉反應。
由于受到技術及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關或相似物質交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)
檢測的其它物質有交叉反應。
[回收率]
分別于定值血清及血漿樣本中加入一定量的EG-VEGF（加標樣品），重復測定并計算其均值，回收率為測定值與理
論值的比率。
樣本回收率范圍(%) 平均回收率(%)
血清(n=5) 91-104 97
EDTA 血漿(n=5) 88-99 94
肝素血漿(n=5) 78-93 85
[線性]
在定值血清及血漿樣本內加入適量的EG-VEGF，并倍比稀釋成1:2，1:4，1:8，1:16 的待測樣本，線性范圍即為
稀釋后樣本中EG-VEGF 含量的測定值與理論值的比率。
樣本1：2 1：4 1：8 1：16
血清(n=5) 85-93% 86-98% 78-92% 90-99%
EDTA 血漿(n=5) 95-103% 98-105% 83-96% 81-94%
肝素血漿(n=5) 80-90% 91-102% 79-97% 87-101%
[精密度]
精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV 表示。CV(%) = SD/mean×100
批內差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續(xù)測定20 次，分別計算不同濃度樣
本的平均值及SD 值。
批間差：選取3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復
測定8 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。
批內差： CV<10%
批間差： CV<12%
[穩(wěn)定性]
經(jīng)測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。
為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕
度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。
[實驗流程]
1、實驗前標準品、試劑及樣本的準備；
2、加樣（標準品及樣本）100μL，37oC孵育2小時；
3、吸棄，加檢測溶液A100μL，37oC孵育1小時；
4、洗板3次；
5、加檢測溶液B100μL，37oC孵育30分鐘；
6、洗板5次；
7、加TMB底物90μL，37oC孵育15－25分鐘；
8、加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。
[說明]
1、由于現(xiàn)有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在
一定的質量技術風險。
2、zui終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關，請務必準備充足的標本
備份。
3、不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內說明書進行
實驗操作，電子版說明書僅作參考。
4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守本試劑盒的
實驗說明才會得到*的檢測結果。
5、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因為蛋白
水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果。
6、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。請勿提前將酶
標板從包裝袋里拿出。
7、由于操作者不熟練、操作失誤或讀數(shù)儀程序選用錯誤等有可能會導致錯誤結果的產生。請使用者使用該產品
前仔細閱讀說明書，調試好酶標儀，請使用配備有450±10nm 濾光片的酶標儀，且該酶標儀測量范圍在
0.001-3.000 O.D.或以上。
8、同一使用者在使用同一產品時，如不同時間訂購，也可能會因不同批次的少量差異產生不同結果，因此建議
使用者在每次使用前均進行預實驗。
9、試劑盒在出廠前均經(jīng)過嚴格檢測，但由于運輸條件及各實驗室條件差異，可能會造成實驗結果與出廠結果不
一致或不同批次試劑盒批間差大的情況，對于這種情況會酌情處理。
10、本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的蛋白的產品做對比，平行檢測可能會存在檢測結
果不一致的情況。
11、本操作說明同樣適用于48T 試劑盒，但48T 試劑盒所有試劑減半。
[警告]
本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。
[問題解答]
問題可能原因解決方案
標準曲線差
標準品準備不正確進行正確的標準品梯度稀釋
吸取及洗滌不充分充分的吸取及洗滌
移液不檢查和校正移液器
精密度低
洗滌不充分按說明書要求充分洗滌和浸泡
混勻不充分和吸取試劑不足充分混勻和吸取試劑
重復利用吸頭、容器和覆膜使用加樣器要更換新的吸頭、使用新的容器和覆膜
加樣不檢查和校正移液器
O.D 值低
每孔加的試劑量不校正移液器，加入試劑
溫育時間不正確保證充足的溫育時間
溫育溫度不正確試劑要平衡至室溫并保證準確的溫育溫度
酶標記物或底物失效通過混合酶標記物和底物，顏色應迅速顯現(xiàn)來檢查
沒有加入終止液按照說明書實驗操作步驟加入終止液
超出讀數(shù)時間讀數(shù)在說明書推薦的讀數(shù)時間內讀數(shù)
樣本值
不正確的樣本儲存方式正確儲存樣本，使用新鮮樣本進行實驗
不正確的樣本收集和處理方法采取正確的樣本收集和處理方法
待測物質在樣本中含量低使用新鮮樣本，重復實驗