如何測(cè)人體zui大微生態(tài)庫(kù)？下一代測(cè)序來(lái)幫忙

在人體中zui大的微生態(tài)庫(kù)是生活在人體消化道微生物復(fù)合群落組成的腸道菌群，別看人體腸道所占體積不大，但是人體腸道內(nèi)寄生著10萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌，它們能影響體重和消化能力、抵御感染和自體免疫疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，還能控制人體對(duì)癌癥治療藥物的反應(yīng)。

人體腸道的正常微生物，如雙歧桿菌，乳酸桿菌等能合成多種人體生長(zhǎng)發(fā)育必須的維生素，如B族維生素（維生素B1、B2、B6、B12），維生素K，煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質(zhì)殘?jiān)铣杀匦璋被?，如天冬門(mén)氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時(shí)還能促進(jìn)鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)人類的健康有著重要作用，一旦缺少會(huì)引起多種疾病。

研究表明慢性疾病，如肥胖癥，炎性腸?。↖BD），糖尿病，代謝綜合征，癥狀性動(dòng)脈粥樣硬化和非酒精性脂肪肝疾病，都與腸道菌群密切相關(guān)。許多國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究由此開(kāi)展，像歐盟的胃腸道元基因組計(jì)劃（MetaHIT），該計(jì)劃的目標(biāo)是建立腸道菌群基因與人類健康疾病的關(guān)系，像美國(guó)2008年推出的人體微生物組計(jì)劃（HMP），為期五年，1.15億美元的總預(yù)算。這個(gè)項(xiàng)目的zui終目標(biāo)是測(cè)試人體菌群變化，以及其與人類健康或疾病的關(guān)聯(lián)性。

在中國(guó)，國(guó)家批準(zhǔn)了感染性疾病相關(guān)腸道微生物的研究計(jì)劃。該項(xiàng)目的目標(biāo)是利用系統(tǒng)生物學(xué)，包括宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)的方法研究感染性疾病的腸道微生物變化。

在這里，特別值得注意的是宏基因組學(xué)，宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)，它通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。

也就是說(shuō)，我們要使用宏基因組學(xué)這個(gè)方法來(lái)研究腸道微生物變化，這個(gè)任務(wù)是非常艱巨的，至少在下一代測(cè)序發(fā)明之前，是不可想象的。

凡是在實(shí)驗(yàn)室使用過(guò)一代測(cè)序--Sanger法測(cè)序的同學(xué)都知道，往往為了測(cè)一小段DNA，首先要將樣品擴(kuò)增，全部過(guò)程下來(lái)，大半天的時(shí)間是起步價(jià)，如果以這個(gè)速度測(cè)腸道菌群的宏基因組學(xué)所需數(shù)據(jù)，那估計(jì)窮極一生，我們也是不肯能完成這個(gè)任務(wù)的。

工欲善其事，必先利其器，那么下一代測(cè)序又是怎樣完成全部測(cè)序任務(wù)的呢？

下一代測(cè)序不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以Helico BioScience 單分子測(cè)序技術(shù)為例，該測(cè)序是基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在 3' 末端加上 poly(A)，以及在poly(A)的末端進(jìn)行熒光標(biāo)記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來(lái)獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊 合成邊測(cè)序的位點(diǎn) 加入聚合酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行DNA 合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對(duì)Cy3成像，觀測(cè)模板位點(diǎn)上是否有熒光信號(hào)，然后化學(xué)裂解核苷酸 上的燃料并釋放 加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。

有此利器在手，測(cè)腸道菌群的宏基因組當(dāng)然不在話下。

在前期研究中，浙江大學(xué)感染性疾病協(xié)同創(chuàng)新中心研究員秦楠，負(fù)責(zé)的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)定量宏基因組技術(shù)對(duì)98個(gè)肝硬化病人和83個(gè)健康人的腸道菌群進(jìn)行了研究。建立了*個(gè)肝硬化參考基因集，包括269萬(wàn)基因，其中36.1%為新基因；肝硬化患者和健康個(gè)體之間基因豐度存在差異，可將它們分為66個(gè)代表同源細(xì)菌物種的組群，其中28個(gè)組群豐富地存在于患者體內(nèi)，38個(gè)組群豐富地存在于對(duì)照個(gè)體中。*次發(fā)現(xiàn)肝硬化患者體內(nèi)存在大量細(xì)菌起源于口腔；找到一種由15個(gè)基因構(gòu)成的生物標(biāo)記物，建立了肝硬化菌群失衡診斷的新標(biāo)準(zhǔn)（PDI指數(shù)），并在一個(gè)獨(dú)立組群中進(jìn)行了驗(yàn)證，可作為肝硬化診斷的強(qiáng)有力工具，該研究?jī)?nèi)容于2014年7月在Nature雜志上發(fā)表。

此次生物谷召開(kāi)的2015 下一代測(cè)序發(fā)展論壇：行業(yè)探討與臨床應(yīng)用，就有幸邀請(qǐng)到了秦楠博士同我們分享下一代測(cè)序在臨床應(yīng)用研究中發(fā)揮的巨大作用。我們熱忱歡迎您的參與，與來(lái)自測(cè)序行業(yè)的企業(yè)單位，研究機(jī)構(gòu)的14位嘉賓共同探討下一代測(cè)序的行業(yè)發(fā)展，臨床應(yīng)用！