2007年，來自丹尼斯克公司（一家總部位于丹麥哥本哈根的食品添加劑公司，目前被杜邦公司收購）的科學(xué)家找到了一種能增強(qiáng)細(xì)菌防御噬菌體能力的方法。之后2013年，四個研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了這一被稱為CRISPR的系統(tǒng)，自此CRISPR技術(shù)紅紅火火的發(fā)展了起來，許多科研團(tuán)隊(duì)利用它來刪除、添加、激活或抑制人體、老鼠、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲和農(nóng)作物細(xì)胞中的目標(biāo)基因。

近期來自蒙大拿州立大學(xué)的兩位學(xué)者以“CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems"為題，介紹了CRISPR-Cas免疫應(yīng)答系統(tǒng)。其中Blake Wiedenheft就是當(dāng)年加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna研究組成員，他們曾于2010年了Csy4核糖核酸內(nèi)切酶原子水平的晶體結(jié)構(gòu)模型——研究人員確定Csy4是一種存在于原核細(xì)胞的酶，它能夠啟動生成CRISPR衍生RNAs (crRNAs)，這種小RNA分子能夠靶向并沉默侵入的病毒和質(zhì)粒。

細(xì)菌和古細(xì)菌進(jìn)化出了復(fù)雜的CRISPR適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這一系統(tǒng)可以分成I-III三個類型，至少有11種不同的亞型：從I-A到I-F，從II-A到II-C，以及III-A和III-B，不過盡管有這些不同，所有的CRISPR-Cas系統(tǒng)都通過三個主要階段來完成功能：采集，CRISPR RNA(crRNA) 生物合成與靶向干擾。

階段1：外源DNA采集

外源核苷酸是通過Cas蛋白來識別的，入侵的短片段DNA（30-50個堿基對）被稱為protospacers，作為間隔序列插入宿主CRISPR位點(diǎn)中，由重復(fù)序列隔開。對于I型和II型系統(tǒng)來說，protospacers來自入侵DNA中兩側(cè)出現(xiàn)2-5個核酸結(jié)構(gòu)（PAM，protospacer adjacent motif）的區(qū)域。一般protospacers連接在CRISPR 位點(diǎn)的一端，并且后者通過涉及Cas1、Cas2和游離3’-hydroxyls等元件的機(jī)制，牽引序列。Protospacer的整合過程中也出現(xiàn)了牽引末端重新序列復(fù)制，這可能涉及宿主聚合酶和DNA修復(fù)機(jī)制。

相關(guān)論文解析：

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

研究人員確定了其中三種anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能機(jī)制。他們對這些蛋白進(jìn)行了生物化學(xué)及體內(nèi)研究，證實(shí)每一個anti-CRISPR蛋白都通過不同的機(jī)制來抑制了CRISPR–Cas的活性。有兩個anti-CRISPR阻斷了CRISPR–Cas復(fù)合物的DNA結(jié)合活性，但它們是通過與不同的蛋白質(zhì)亞基互作，利用了空間或非空間抑制模式來做到這一點(diǎn)的。第三種anti-CRISPR蛋白通過結(jié)合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到結(jié)合DNA的CRISPR–Cas復(fù)合物上來起作用。在體內(nèi)，這一anti-CRISPR可以將CRISPR–Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄遏制物，證實(shí)了一種蛋白質(zhì)相互作用蛋白可以調(diào)控CRISPR–Cas活性。作者們認(rèn)為，這些anti-CRISPR蛋白質(zhì)不同的序列及作用機(jī)制表明了獨(dú)立的進(jìn)化，并預(yù)示了還存在其他的方式——蛋白質(zhì)借助于它們改變了CRISPR–Cas的功能。

新研究探討了蛋白質(zhì)抑制CRISPR–Cas系統(tǒng)的機(jī)制。這些多樣且不同的機(jī)制反映了病毒-宿主軍備競賽深層的進(jìn)化根源。這些已知和尚有待發(fā)現(xiàn)的Anti-CRISPR，將為認(rèn)識和操控CRISPR–Cas系統(tǒng)提供大量有價值的工具。其中一個例子就是，新研究發(fā)現(xiàn)AcrF3通過阻止招募Cas3將CRISPR–Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱艘粋€基因調(diào)控因子。由于除了破壞外源DNA，CRISPR–Cas系統(tǒng)來執(zhí)行著各種功能，許多重要的功能有可能是由與CRISPR–Cas元件互作，由此改變了這一系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)來完成。

階段2：crRNA合成

CRISPR RNA生物合成在轉(zhuǎn)錄之后，生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：pre-crRNA，之后經(jīng)過加工，又成為一組短小的CRISPR 衍生RNAs（crRNAs），這些crRNAs每一個都包含有對應(yīng)于之前遇到的外源DNA的對應(yīng)序列。

CrRNAs導(dǎo)向序列兩端是相鄰重復(fù)序列區(qū)域，在I型和II型系統(tǒng)中，這種CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會被CRISPR特異性核酸內(nèi)切酶（Cas6 或 Cas5d）切割，切割位點(diǎn)位于重新序列。許多I型系統(tǒng)的重新序列會出現(xiàn)多次，因此Cas6也需要穩(wěn)定連接在crRNA 3’端莖環(huán)上。對于III型系統(tǒng)來說，Cas6則是短暫連接，crRNA 3’端會進(jìn)一步通過未知的酶處理。

II型系統(tǒng)中，CRISPR RNA加工過程則取決于反式作用 crRNA (tracrRNA)，tracrRNA包含一個重復(fù)序列的互補(bǔ)序列，這些雙螺旋區(qū)域在Cas9出現(xiàn)時可以通過RNase III 進(jìn)行處理。

相關(guān)論文解析：

CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea.

這篇發(fā)表在Annu. Rev. Biochem. 雜志上的文章十分重要，解析了crRNA合成過程，以及其后的靶向干擾中的幾個重要步驟，此后也被多人引用。

Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering

張鋒的這篇綜述概述了CRISPR/Cas9作為一種平臺技術(shù)的開發(fā)狀況以及在基因組編輯方面的應(yīng)用，也討論了其存在的一些挑戰(zhàn)，以及未來的創(chuàng)新之路。

階段3：靶向干擾

成熟的crRNAs能指導(dǎo)Cas蛋白靶向互補(bǔ)靶標(biāo)，靶標(biāo)序列由Cas 核酸酶降解，但其靶標(biāo)降解的機(jī)制存在差異。I型和II型系統(tǒng)都可以靶向包含PAM和protospacer互補(bǔ)序列的dsDNA底物。III型系統(tǒng)則不依賴于 PAM作為識別序列，而是通過導(dǎo)向序列延伸至crRNA信號5'handle的核苷酸進(jìn)行識別（CRISPR位點(diǎn)包含與導(dǎo)向序列，5'handle互補(bǔ)的序列），并阻止靶向切割。

相關(guān)論文解析：

Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity

一些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)病毒入侵細(xì)菌細(xì)胞時，稱作為III型CRISPR-Cas的這一機(jī)制會靶向病毒的DNA，阻止它利用細(xì)菌的機(jī)器來拷貝自身及感染更多的細(xì)菌。但另外的一些實(shí)驗(yàn)表明，III型CRISPR-Cas只能通過切割病毒RNA來讓病毒喪失能力。

洛克菲勒大學(xué)的研究人員他們檢測了III型CRISPR-Cas對DNA和RNA的切割，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了從前其他人沒有得到過的一個關(guān)鍵成分，并發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas確實(shí)切割了病毒DNA生成的RNA，但它也切割了病毒的DNA。

這種雙交叉系統(tǒng)有一些優(yōu)勢。許多的病毒整合到它們感染細(xì)胞的基因組中保持休眠狀態(tài)，不會造成損傷。事實(shí)上，這些病毒對于細(xì)菌可能是有益的，例如它們攜帶的毒素幫助了細(xì)菌促進(jìn)自身生存。舉例說來，白喉毒素是由一種細(xì)菌所分泌，但編碼這一毒素的基因卻來自于一種病毒。只有在病毒開始將它們的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA之時才會讓它們喪失功能，通過設(shè)置這樣的要求III型CRISPR-Cas不會損及休眠病毒，使得它們可以繼續(xù)讓宿主細(xì)菌受益。

循環(huán)關(guān)閉

I型系統(tǒng)中，監(jiān)測復(fù)合物中靶向結(jié)合會導(dǎo)致Cas3介導(dǎo)的靶向降解（直接干擾）或zui初采集，這其中涉及crRNA導(dǎo)向募集Cas3、Cas1 和Cas2到外源DNA處，引起新一輪的快速采集。

II型系統(tǒng)中雖然未觀察到zui初采集，但Cas9 也是protospacer篩選的必要元件，這表明在靶向干擾與外源DNA采集之間存在一種功能性。近期還有研究發(fā)現(xiàn)了編碼anti-CRISPRs 蛋白的不同病毒基因，這也是指出了干擾以上不同階段，能顛覆CRISPRs 系統(tǒng)。

Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation.

一些證據(jù)表明，某些Cas酶（未包括Cas9）自身可以操控記憶形成過程?；贑as9識別切割位點(diǎn)的方式，研究人員猜測Cas9在記憶形成中也發(fā)揮了作用。

除了匹配CRISPR引導(dǎo)序列和病毒DNA，Cas9需要在附近尋找第二信號：病毒DNA中的前間區(qū)序列鄰近基序( protospacer adjacent motif，PAM)序列。這是一個至關(guān)重要的步驟，因?yàn)镻AM序列的存在阻止了Cas9攻擊細(xì)菌自身包含記憶的DNA。

為了檢驗(yàn)他們的假說，研究人員交換了化膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌免疫系統(tǒng)的Cas9酶，它們各自識別不同的PAM序列。結(jié)果，PAM序列跟隨著在兩種細(xì)菌之間發(fā)生了交換——表明在記憶形成中Cas9負(fù)責(zé)了PAM的識別。

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

研究人員確定了其中三種anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能機(jī)制。他們對這些蛋白進(jìn)行了生物化學(xué)及體內(nèi)研究，證實(shí)每一個anti-CRISPR蛋白都通過不同的機(jī)制來抑制了CRISPR–Cas的活性。有兩個anti-CRISPR阻斷了CRISPR–Cas復(fù)合物的DNA結(jié)合活性，但它們是通過與不同的蛋白質(zhì)亞基互作，利用了空間或非空間抑制模式來做到這一點(diǎn)的。第三種anti-CRISPR蛋白通過結(jié)合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到結(jié)合DNA的CRISPR–Cas復(fù)合物上來起作用。在體內(nèi)，這一anti-CRISPR可以將CRISPR–Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄遏制物，證實(shí)了一種蛋白質(zhì)相互作用蛋白可以調(diào)控CRISPR–Cas活性。作者們認(rèn)為，這些anti-CRISPR蛋白質(zhì)不同的序列及作用機(jī)制表明了獨(dú)立的進(jìn)化，并預(yù)示了還存在其他的方式——蛋白質(zhì)借助于它們改變了CRISPR–Cas的功能。

新研究探討了蛋白質(zhì)抑制CRISPR–Cas系統(tǒng)的機(jī)制。這些多樣且不同的機(jī)制反映了病毒-宿主軍備競賽深層的進(jìn)化根源。這些已知和尚有待發(fā)現(xiàn)的Anti-CRISPR，將為認(rèn)識和操控CRISPR–Cas系統(tǒng)提供大量有價值的工具。其中一個例子就是，新研究發(fā)現(xiàn)AcrF3通過阻止招募Cas3將CRISPR–Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱艘粋€基因調(diào)控因子。由于除了破壞外源DNA，CRISPR–Cas系統(tǒng)來執(zhí)行著各種功能，許多重要的功能有可能是由與CRISPR–Cas元件互作，由此改變了這一系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)來完成。