免疫組化染色過程中存在的問題

良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán) 節(jié)，每一個步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的zui終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一 件非常容易的事。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組 化切片。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問題，但從染色的結(jié)果看，一般可分為兩類：無色片（即 無陽性信號）和“雜音”染色片（有陽性信號）。 一、 無色片 染色結(jié)束后，切片中見不到任何陽性信號。這是常規(guī)工作中比較常見的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能： 1、真陰性結(jié)果：整個染色過程沒有出現(xiàn)問題，組織或細(xì)胞確實不表達與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結(jié)果： 即此陰性結(jié)果不是真實的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）、切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組 織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是病理醫(yī)生選擇錯了切片或抗體選錯了，要麼是技術(shù)員選錯了蠟塊。獲得 正確的切片進行染色是獲得正確結(jié)果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術(shù)員的事， 病理醫(yī)生也起著*的作用。（2）、染色過程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問題。比如，組織未進行抗原修 復(fù)，有的組織必須經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測抗原表達；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織 的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長 期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或 用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制 DAB 時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法： 在三抗孵育結(jié)束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的 DAB 滴一滴在白紙的三抗上，觀察是 否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和 DAB 的配制過程沒有錯誤。如果這種 DAB 再滴到切片上沒有出現(xiàn) 任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問題肯定在三抗 DAB 或 DAB 的配 制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問題可能的原因。 解決陰性染色的問題非常簡單，就是設(shè)立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達，說明染色的全過程 和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表 達。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應(yīng)一一尋 找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內(nèi)部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在 已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在 T 和 B 細(xì)胞抗原，CD20或 CD3都應(yīng)該有表達。自身對照是一種比較理想 的對照，對照和測試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比 性。在選擇自身對照片時選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為 “外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用 HMB45或 Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果，尚能提 示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問題。因此， 應(yīng)另外設(shè)立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實際工作中需要 設(shè)立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。為了解決這個問題， 目前國內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等， 其連續(xù)切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性 對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神 、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數(shù)常用的抗體。 設(shè)立陽性對照是病理醫(yī)生的任務(wù)或責(zé)任，而不是技術(shù)員的責(zé)任。病理醫(yī)生觀察了 HE 切片，了解切片中 是否有自身對照，如果沒有，就應(yīng)告訴技術(shù)員采用陽性對照。因此，病理醫(yī)生在免疫組化中的作用是不可 忽視的。 抗體未覆蓋上測試組織：當(dāng)多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。 二、“雜音”染色片 免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音” 染色。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說明，筆者將其歸納為下面幾種 1、 全片著色 全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是 陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有： （1） 抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工 作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如 此，不能只簡單的按說明書進行染色。 （2） 抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報時表或報時 鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的 時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整。 （3） DAB 變質(zhì)和顯色時間太長：DAB 現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進行過濾后再用。配制好的 DAB 不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產(chǎn)生反應(yīng)而降低 DAB 的 效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB 的顯色在顯微鏡 下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實， 但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。 （4） 組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等 都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈，可 以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。 （5） 切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗 室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在 4ºC 冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此， 不可存放時間太長。 （6） 一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新 買的抗體時設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。 2、 切片邊緣著色 切片邊緣著色也是一種常見的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因： （1） 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。 解決辦法：制備的膠片（APES 或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處 理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。 （2） 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解 決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2 mm。用 DAKO 筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng) 距組織邊緣3-4 mm。 3、“陰陽臉”著色 指組織一半著色一半無著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分 組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍， 是否有的組織未被試劑*覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之 將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但后來試劑流向一邊， 部分組織未被試劑覆蓋。對于這種問題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。有時，用 DAKO （或 PAP）筆在組織周圍畫圈時，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達到靠近 劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽分明的著色，只是不著色區(qū)域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被 推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決辦法是滴加試劑時手法要輕，有氣泡時用牙簽捅破。 4、 灶片狀著色 切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問題的原因有： （1） 裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入后不易洗盡，顯色過深所致。解決 辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。 （2） 壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如 Fc 段）可能 與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致zui終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。 （3） 制作 APES 膠片時，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決辦 法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進行，即5%鹽酸酒精（5ml 鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片 1小時、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2 ml APES+98 ml 丙酮） 浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37°C 過夜干燥、室溫儲存 備用。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時可適當(dāng)加入一些丙酮。 5、 間質(zhì)著色 著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團相互作用形成非特 異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白 常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是 lambda 和 kappa 染色時。當(dāng)甲狀腺膠 質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時，做甲狀腺球蛋白染色也會出現(xiàn)間質(zhì)著色。抗體不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色， 我們曾遇到 CD20抗體不純，除了染上 B 細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。 6、 細(xì)胞漿著色 胞漿著色是所有“雜音”染色中有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無著色，看上去與 真實的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見 于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色， 如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）、過氧化氫酶（肝、腎），這 些可用過氧化氫進行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或 Fc 片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但 可以通過形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色有欺騙性，因為它廣泛的存在于組 織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉， 加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露，內(nèi)源性生物素暴露的強度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+） 到強陽性（+++），內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存 在于胞漿中，內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源 性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物素暴露的強弱與修復(fù)液有關(guān)，其強度增加依次為： 檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測系統(tǒng) Polymer 兩 步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干擾。 7、 細(xì)胞核著色 不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲苯里浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期 一）、緩沖液中浸泡時間太長、組織變干、微波修復(fù)液的 pH 值和修復(fù)時間不當(dāng)或修復(fù)過程中修復(fù)液留下得 太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進行工作。