細(xì)胞傳代準(zhǔn)備工作
3.1.1細(xì)胞傳代所需培養(yǎng)液及試劑需提前放置于生物安全柜內(nèi)預(yù)熱至室溫備用。
3.1.2細(xì)胞傳代材料，滴管、移液管、培養(yǎng)器皿、計數(shù)板、橡皮乳頭。
3.2細(xì)胞傳代步驟
3.2.1人無菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒雙手。
3.2.2細(xì)胞傳代前先在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)觀察。
3.2.3打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面30 min左右，關(guān)閉超凈工作臺的紫外燈，打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。
3.2.4超凈工作臺面應(yīng)整潔，用75％酒精溶液擦凈。
3.2.5貼壁細(xì)胞的傳代
3.2.5.1貼壁細(xì)胞用滴管或移液管吸去培養(yǎng)器皿中的舊培養(yǎng)液。
3.2.5.2酌情可用2～3 mL 0.02%EDTA溶液洗去殘留的舊培養(yǎng)基。
3.2.5.3以25ml培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。
3.2.5.4在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓或細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終至消化。
3.2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)液，終至消化。
3.2.5.6用彎頭滴管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，形成細(xì)胞懸液。
3.2.5.7計數(shù)，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)液(7～10ml／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。
3.2.6半懸浮細(xì)胞及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的傳代
3.2.6.1半懸浮細(xì)胞先用滴管將細(xì)胞輕輕吹下來，把細(xì)胞懸浮液加入離心管離心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
3.2.6.2把細(xì)胞沉淀制成懸液，計數(shù)，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)液移到培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。
3.2.6.3懸浮細(xì)胞直接用滴管或移液管吸入離心管離心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
3.2.6.4把細(xì)胞沉淀制成懸液，計數(shù)，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)液移到培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。
3.2.6.5將培養(yǎng)器皿放回CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（培養(yǎng)瓶培養(yǎng)需將瓶蓋旋開半圈）。
3.2.6.6操作完畢，填寫“細(xì)胞培養(yǎng)傳代記錄”。
3.3注意事項(xiàng)
3.3.1傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。
3.3.2每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。
3.2.4細(xì)胞培養(yǎng)傳代吹打要輕柔不用用力過猛同時盡可能不要出現(xiàn)泡沫，這些都對細(xì)胞有損傷。