EHA101 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

EHA101 Elec：                                                            50μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl )                            10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個(gè)月）

基因型

C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline

EHA101 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：kan，賦予EHA101菌株卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。開發(fā)的EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒 (壯觀霉素抗性，size:11876 bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經(jīng)pK7WGF2-ZH質(zhì)粒（size:40 kd）檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×10³ cfu/μg DNA。。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高，一次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養(yǎng)48小時(shí)即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60小時(shí)；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90小時(shí)）。

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

注意事項(xiàng)

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。