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當前位置:上海信裕生物科技有限公司>>細胞系>>感受態(tài)細胞>> AH109 Chemically Competent Cell
產(chǎn)品型號
品 牌其他品牌
廠商性質(zhì)生產(chǎn)商
所 在 地上海
更新時間:2020-09-02 16:57:48瀏覽次數(shù):695次
聯(lián)系我時,請告知來自 化工儀器網(wǎng)DH5α Chemically Competent Cell
XL10-Gold Chemically Competent Cell
DB3.1 Electroporation-Competent Cel
DB3.1 Chemically Competent Cell
純度 | 99.99% | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
---|---|---|---|
規(guī)格 | 100μl/支 | 貨號 | XY9077 |
應用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè) | 主要用途 | AH109菌株來源于PJ69-2A 酵母菌株,將lacZ報告基因引入PJ69-2 |
AH109 Chemically Competent Cell
產(chǎn)品規(guī)格
AH109 Competent Cell: 100μl/支 保存: -80℃(3個月)
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存:-80℃(12個月)
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存:-20℃(12個月)
PEG/LiAC: 5ml 保存: 4℃(12個月)
基因型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS- GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
AH109 Chemically Competent Cell產(chǎn)品說明
AH109菌株來源于PJ69-2A 酵母菌株,將lacZ報告基因引入PJ69-2A誕生了AH109,此菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株,MATa型,可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為:trp1,leu2,報告基因為:lacZ,HIS3,ADE2,MEL1。AH109-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用:pGBKT7和pGADT7。質(zhì)粒pGBKT7的篩選標志為TRP1,用于表達DNA-BD(來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白;質(zhì)粒pGADT7的篩選標志為LEU,用于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理:一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結(jié)構(gòu)域:位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并與之結(jié)合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨存在不能激活轉(zhuǎn)錄,但當二者接近時,則呈現(xiàn)完整的GAL4活性,使含有UAS的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達。正常條件下,BD不與AD結(jié)合,將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合,形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和 prey發(fā)生相互作用,就會促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109有四個報告基因:lacZ,HIS3,ADE2,MEL1,分別由三種不同的啟動子 (GAL1,GAL2,MEL1)啟動,這三種啟動子只有GAL4識別的17 bp核心區(qū)相同,其余部分均不同,大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。AH109感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取100 µl冰上融化的AH109感受態(tài)細胞,依次加入預冷的目的質(zhì)粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴,重復一次) 10 µl,PEG/LiAc 500µl并吸打幾次混勻,30度水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
3. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 µl 重懸,離心 30s棄上清。
4. ddH2O 50 µl重懸,涂板,29℃培養(yǎng)48-96 h。
注意事項
1. 感受態(tài)細胞在冰上融化。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應減少終用于涂板的菌量。
3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。
4. AH109酵母菌株對高溫敏感,適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克??;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。
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