YM4271 Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

YM4271 Competent Cell:                                        100μl/支            保存： -80℃（3個(gè)月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl               保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個(gè)月）

基因型

MATa, ura3–52, his3-Δ200, ade2–101, ade5, lys2–801, leu2–3,112, trp1–901, tyr1–501, gal4Δ, gal80Δ, ade5::hisG

YM4271 Chemically Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

YM4271菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATα型酵母菌株EGY48、Y187等通過mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為：trp1，leu2，ura，報(bào)告基因?yàn)椋?em> HIS3?？捎糜诮湍鸽p雜，酵母單雜或異源蛋白表達(dá)等試驗(yàn)。YM4271感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取100 µl冰上融化的YM4271感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100℃，5 min，快速冰浴，重復(fù)一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打幾次混勻，30℃水浴30 min (15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH₂O 50 µl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. YM4271酵母菌株對(duì)高溫敏感，適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。