Stable Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

Stable                                                                       50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（6個月）

基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC)

Stable Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明

Stable電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不可用于熱激轉(zhuǎn)化。Stable菌株是NEB公司開發(fā)的高轉(zhuǎn)化效率菌株，是逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株，特別適合慢病毒或具有末端重復(fù)序列DNA段的克隆?；蚪M含有重組酶recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復(fù)區(qū)的重組，降低錯誤重組的概率；同時含有核酸酶endA1突變，避免了提取質(zhì)粒過程中核酸酶的污染，大大提高了高純度病毒質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量。lacZΔM15的存在使Stable可用于藍(lán)、白斑篩選，此菌株具有四環(huán)素和鏈霉素抗性。開發(fā)的Stable電擊感受態(tài)細(xì)胞適用于大質(zhì)粒的構(gòu)建或者各種具有末端重復(fù)序列的復(fù)雜DNA文庫構(gòu)建，經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>1×10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的Stable電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

    A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19；

    B. 對于連接產(chǎn)物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)或ddH2O重懸，             DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1 ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。傾斜放入搖床，30℃，250 rpm復(fù)蘇90分鐘。

      當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率，則                         需37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的LB平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)20-24小時。

注意事項

1. 對不穩(wěn)定DNA段的克隆或逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體的構(gòu)建，涂板后平板應(yīng)在30℃培養(yǎng)，以減少發(fā)生錯誤重組的概率。2. 制備高純度病毒質(zhì)粒時，應(yīng)使用新鮮轉(zhuǎn)化的平板接菌，新鮮菌液提取質(zhì)粒，菌液不可低溫保存后提取質(zhì)粒。

3. 感受態(tài)細(xì)胞在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率?；烊肽康腄NA時應(yīng)輕柔操作。

4. 加入DNA時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

5. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。

6. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

7. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。

8. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

9. 對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險。

10. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

11. 電擊感受態(tài)細(xì)胞保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。