胸膜肺炎放線桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Abalone Herpes-like Virus(AbHV) SYBR qPCR Kit

產(chǎn)品及特點

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是一種呼吸道寄生菌，主要存在于患病動物的肺部和扁桃體，病豬和帶菌豬是本病的主要傳染源。本病的感染途徑是呼吸道，即通過咳嗽、噴嚏噴出的分泌物和滲出物而傳播，而接觸傳播可能是其主要的傳播途徑。國內(nèi)外的研究及臨床實踐表明，豬患呼吸系統(tǒng)疾病時，容易發(fā)生繼發(fā)感染或混合感染。如本病與豬偽狂犬、蘭耳病、多殺性巴氏桿菌、肺炎霉形體、嗜血桿菌等病原的混合感染，應(yīng)引起高度重視，因此快速檢測胸膜肺炎放線桿菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測胸膜肺炎放線桿菌的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供DNA模板。

2.特異性高，引物是根據(jù)人胸膜肺炎放線桿菌高度保守區(qū)設(shè)計,不會擴增其他細菌。

3.引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī)PCR高100倍。

4.提供無傳染性的PCR陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5.一管式操作，熒光PCR檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6.本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR。

胸膜肺炎放線桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 樣品DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA段作為陽性對照。
1.標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號管中加入5 μL 陽性對照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8.如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。本試劑盒免費贈送20次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）

9.如果進行定量分析，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則6個標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個做（可以選4號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

 11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

五、數(shù)據(jù)處理
12.設(shè)定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。

13.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

14.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。