雙歧桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Bifidobacterium spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類存在于人體中非常重要的專性厭氧菌，于 1899 年首先在母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離，研究證實(shí)雙歧桿菌具有平衡腸 道菌群、降膽固醇、延緩衰老及抗腫瘤等生理功能，是人體益生菌群的主要組成。添加 雙歧桿菌的微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)研究已成為一大熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)療等領(lǐng)域。 但不斷有報(bào)道指出國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上雙歧桿菌微生態(tài)制劑標(biāo)示名稱混亂，很多國(guó)家市場(chǎng)上雙 歧桿菌制品假冒代替現(xiàn)象嚴(yán)重。針對(duì)該現(xiàn)象，開(kāi)發(fā)了針對(duì)雙歧桿菌特異性檢測(cè)試劑盒， 本產(chǎn)品利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，通過(guò)熒光染料實(shí)時(shí)顯示樣品雙歧桿菌模板 DNA 的量, 并通過(guò)坐標(biāo)曲線表示出來(lái), 結(jié)果直觀準(zhǔn)確。它具有下列特點(diǎn)： 

1. 根據(jù)雙歧桿菌屬 tuf 基因，設(shè)計(jì)的針對(duì)雙歧桿菌的 PCR 引物，克服了其他細(xì)菌的 干擾。

2. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。

3. 熒光定量 PCR 檢測(cè)，反應(yīng)特異性強(qiáng)。

4. 本試劑盒可以進(jìn)行 100 次 20uL 體系的 qPCR 反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

雙歧桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存(B 袋的陽(yáng)性對(duì)照一定要放擴(kuò)增區(qū)，A 袋的試劑放樣品準(zhǔn)備區(qū))，有 效期一年。 

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化雙歧桿菌樣品的 DNA，

二、引物的制備（在樣品制備室進(jìn)行）

2. 按引物標(biāo)簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見(jiàn)引物試管上 的標(biāo)簽），使得兩條引物的濃度均為 10 uM（10pmol/uL）。

三、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E3-10E7 這 5 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體菌做陽(yáng)性對(duì)照，只 提供可以直接使用的長(zhǎng)為 339bp 的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

3. 標(biāo)記 5 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3 號(hào)。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 先將本試劑盒提供的雙歧桿菌 Tuf 基因陽(yáng)性對(duì)照用超純水 10 倍梯度稀釋到 10E8 拷貝/μL。放冰上待用。

6. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 10E8 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用

 7. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽(yáng)性對(duì)照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

8. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 10E6 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽(yáng)性對(duì)照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

9. 換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 10E5 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽(yáng)性對(duì)照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E4 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

10. 換槍頭，在 3 號(hào)管中加入 5 μL 10E4 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽(yáng)性對(duì)照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E3 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用

三、設(shè)置 PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

11. 在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管 和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有成分蓋上蓋子 儲(chǔ)存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。 

13. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)， 大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光 譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 以 Tuf 基因序列陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 再以待測(cè)樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過(guò)待測(cè)樣品的 Ct 值計(jì)算出樣 品 DNA 的濃度。