牛呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Bovine Coronavirus(BCoV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

呼腸孤病毒是具分節(jié)段的雙鏈 RNA 基因組的一類(lèi)病毒，分布廣，病毒粒呈球 形，大小在 60-80 納米之間的 20 面體結(jié)構(gòu)。本產(chǎn)品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開(kāi)發(fā)，專(zhuān)門(mén)檢測(cè)牛呼腸孤病毒的試劑盒。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。

2. 根據(jù)牛呼腸孤病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè)，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中 間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

牛呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需 要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供 RNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。 

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò) 散傳染性病原。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重 復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

5. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì) 照梯度稀釋液中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷 貝）再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣 品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。

6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用 于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如 果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用 于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用 于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析 的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。

8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置 完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

 按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于 或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。