側孢短芽孢桿菌染料法qPCR試劑盒

Brevibacillus laterosporus

產品及特點

在延遲期， 短芽孢桿菌為革蘭氏染色陰性，菌體呈細長的桿狀；在對數(shù)生 長期，為革蘭氏染色陽性，菌體成短而粗的桿狀；在靜止期，革蘭氏染色又轉為 陰性，菌體成細長的桿狀，偶爾也能觀察到橢圓形的芽孢。本產品就是以染料法 熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測側孢短芽孢桿菌的試劑盒，它具有下 列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物根據側孢短芽孢桿菌高度保守區(qū)設計，不會擴增其他微生物。

3. 引物和擴增體系經過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產生環(huán)境污染。

6. 本產品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

側孢短芽孢桿菌染料法qPCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備 7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產品兼容。

8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做定 性分析，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應設置。

10. 在標記管中按下表加入各成分

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應參數(shù)

 按儀器預設程序進行熔解曲線分析

五、數(shù)據處理

12. 設定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 37。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 37 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-37 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 37 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。