隱孢子蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Cryptosporidium spp

產品及特點

隱孢子蟲(Cryptosporidium)為體積微小的球蟲類寄生蟲，廣泛存在多種脊椎動 物體內，寄生于人和大多數哺乳動物的主要為微小隱孢子蟲(C. parvum)，引起隱孢子 蟲病(cryptosporidiosis)，是一種以腹瀉為主要臨床表現的人畜共患性原蟲病，因此對 隱孢子蟲進行快速靈敏的診斷具有重要的意義。本產品就是根據隱孢子蟲 rRNA 編碼基 因的保守區(qū)設計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產品。本試劑盒具有下列特點： 

1. 根據隱孢子蟲 OWP（oocyst wall protein）編碼基因保守序列設計的專一性引物， 與其他腸道疾病病原體 

2. 靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個數量級，可以達到幾十拷貝/反應。

3. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 100 次 20uL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

隱孢子蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準備區(qū)、C 袋的陽性對照分開放置)，有效期 一年。 

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數原蟲 DNA 提取試劑盒兼 容。本公司的柱式糞便 DNA 提取試劑盒也可以用于隱孢子蟲 DNA 提取。 二、引物的制備（在樣品制備室進行）

2. 按引物標簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見引物試管上 的標簽），使得兩條引物的濃度均為 10μM（10pmol/μL），然后各取 110μL 混 合在一起得 220μL，標注為引物混合物，放冰上待用。220μL 足夠 100 次 qPCR 反應。

三、稀釋陽性對照

（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供可以直接使用的長為 150bp 的 DNA 段作為陽性對照。

3. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

8. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得 1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

9. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行） 10. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次。樣品管 和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子 儲存好后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行 優(yōu)化）。

12. 數據采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進行。一般在復性步驟采集熒光數據。本產品中所 含的熒光染料在不結合 DNA 時，大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的大 吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光譜在 530 nm。

四、數據處理

13. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品 的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。